umwelt-online-Demo: Archivdatei - Entscheidung 2002/657/EG zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen (1)

Entscheidung 2002/657/EG der Kommission vom 14. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen

(Bekannt gegeben unter Aktenzeichen K(2002) 3044)
(Text von Bedeutung für den EWR)

(ABl. Nr. L 221 vom 17.08.2002 S. 8, ber L 239 S. 66;
Entsch. 2003/181 - ABl. Nr. L 71 vom 15.03.2003 S. 17;
Entsch. 2004/25 - ABl. Nr. L 6 vom 10.01.2004 S. 38;
VO (EU) 2021/808 - ABl. L 180 vom 21.05.2021 S. 84^{Übergangsmaßnahmen}aufgehoben)

gestützt auf die Richtlinie 96/23/EG des Rates vom 29. April 1996 über Maßnahmen zur Kontrolle bestimmter Stoffe und ihrer Rückstände in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen und zur Aufhebung der Richtlinien 85/358/EWG und 86/469/EWG und der Entscheidungen 89/187/EWG und 91/664/EWG¹, insbesondere auf Artikel 15 Absatz 1 Satz 2,

(1) Das Vorhandensein von Rückständen in Erzeugnissen tierischen Ursprungs ist ein Problem des Schutzes der öffentlichen Gesundheit.

(2) Die Entscheidung 98/179/EG der Kommission vom 23. Februar 1998 zur Festlegung von Einzelheiten betreffend die amtliche Probenahme für die Kontrolle bestimmter Stoffe und ihrer Rückstände in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen² sieht vor, dass die Analyse der Proben ausschließlich von Laboratorien durchzuführen ist, die von der zuständigen einzelstaatlichen Behörde für die amtliche Rückstandskontrolle zugelassen worden sind.

(3) Es ist notwendig, die Qualität und die Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse sicherzustellen, die von den für die amtliche Rückstandskontrolle zugelassenen Laboratorien gewonnen werden. Dies muss erreicht werden durch die Anwendung von Qualitätssicherungssystemen und speziell durch die Anwendung von Methoden, die nach allgemeinen Verfahren und Leistungskriterien validiert sind, sowie durch die Rückverfolgbarkeit auf allgemeine Normen oder gemeinschaftlich vereinbarte Normen.

(4) Gemäß der Richtlinie 93/99/EWG des Rates vom 29. Oktober 1993 über zusätzliche Maßnahmen betreffend die amtliche Kontrolle von Nahrungsmitteln 8 und der Entscheidung 98/179/EG müssen amtliche Kontrollaboratorien ab Januar 2002 gemäß ISO 17025³ akkreditiert sein. Gemäß der Entscheidung 98/179/EG müssen zugelassene Laboratorien an einem international anerkannten externen Programm zur Bewertung der Qualitätskontrolle und zur Akkreditierung teilnehmen. Außerdem müssen die zugelassenen Laboratorien ihre Kompetenz durch regelmäßige und erfolgreiche Teilnahme an entsprechenden Eignungsprüfungen nachweisen, die von den einzelstaatlichen oder gemeinschaftlichen Referenzlaboratorien anerkannt oder organisiert werden.

(5) Ein Netzwerk von gemeinschaftlichen Referenzlaboratorien, einzelstaatlichen Referenzlaboratorien und einzelstaatlichen Kontrollaboratorien ist gemäß Richtlinie 96/23/EG tätig, um die Koordination zu verbessern.

(6) Aufgrund von Fortschritten in der chemischen Analytik seit der Verabschiedung der Richtlinie 96/23/EG ist an die Stelle des Konzepts der Routinemethoden und Referenzmethoden der Kriterienansatz getreten, bei dem Leistungskriterien und Verfahren für die Validierung von Screening- und Bestätigungsmethoden festgelegt werden.

(7) Es müssen gemeinsame Kriterien für die Auswertung der Testergebnisse von amtlichen Kontrollaboratorien bestimmt werden, um eine harmonisierte Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG sicherzustellen.

(8) Es müssen nach und nach Mindestleistungsgrenzen (MRPL) von Analysenmethoden für Stoffe festgelegt werden, für die kein zulässiger Grenzwert festgesetzt worden ist, und insbesondere für diejenigen Stoffe, deren Anwendung in der Gemeinschaft nicht zugelassen oder ausdrücklich verboten ist, um eine harmonisierte Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG sicherzustellen.

(9) Die Entscheidung 90/515/EWG der Kommission vom 26. September 1990 zur Festlegung der Referenzmethoden zum Nachweis von Schwermetall- und Arsenrückständen⁴, die Entscheidung 93/256/EWG vom 14. April 1993 zur Festlegung der Methoden zum Rückstandsnachweis von Stoffen mit hormonaler bzw. thyreostatischer Wirkung⁵ und die Entscheidung 93/257/EWG der Kommission vom 15. April 1993 zur Festlegung der Referenzmethoden und des Verzeichnisses der nationalen Referenzlaboratorien für Rückstandsuntersuchungen⁶, zuletzt geändert durch die Entscheidung 98/536/EG⁷, sind überprüft worden, um dem wissenschaftlich-technischen Fortschritt Rechnung zu tragen, haben sich in ihrem Geltungsbereich und ihren Bestimmungen als veraltet erwiesen und sollten demgemäß mit dieser Entscheidung aufgehoben werden.

(10) Damit Methoden für die Analyse von amtlichen Proben an die Bestimmungen dieser Entscheidung angepasst werden können, sollte ein Übergangszeitraum festgesetzt werden.

(11) Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Ausschusses für die Lebensmittelkette und Tiergesundheit

Diese Entscheidung legt Regeln für die Analysemethoden fest, die bei der Analyse von amtlichen Proben, die gemäß Artikel 15 Absatz 1 Satz 2 der Richtlinie 96/23/EWG entnommen werden, zu verwenden sind und bestimmt gemeinsame Kriterien für die Auswertung von Analysenergebnissen amtlicher Kontrollaboratorien für solche Proben.

Diese Entscheidung gilt nicht für Stoffe, für die in anderen gemeinschaftlichen Rechtsvorschriften speziellere Regelungen festgelegt worden sind.

Für diese Entscheidung gelten die Begriffsbestimmungen in der Richtlinie 96/23/EG sowie im Anhang I dieser Entscheidung.

Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass amtliche Proben, die gemäß der Richtlinie 96/23/EG entnommen werden, mit Methoden analysiert werden, die:

Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass die Analysemethoden zur Feststellung folgender Stoffe die in Anhang II aufgeführten Mindestleistungsgrenzen (MRPL) auf der Grundlage der in dem genannten Anhang aufgeführten Matrizes erfüllen:

Die Mitgliedstaaten stellen die Qualität der Analysenergebnisse von Proben sicher, die gemäß Richtlinie 96/23/EG entnommen wurden, insbesondere durch die Überwachung der Tests bzw. der Kalibrierungsergebnisse gemäß Kapitel 5.9 der ISO 17025 (1).

(1) Das Ergebnis einer Analyse gilt als positiv, wenn die Entscheidungsgrenze der Bestätigungsmethode für den Analyten überschritten ist.

(2) Wenn ein zulässiger Grenzwert für einen Stoff festgelegt worden ist, ist die Entscheidungsgrenze die Konzentration, über der mit einer statistischen Sicherheit von 1 - a festgestellt werden kann, dass der zulässige Grenzwert tatsächlich überschritten worden ist.

(3) Wenn kein zulässiger Grenzwert für einen Stoff festgelegt worden ist, ist die Entscheidungsgrenze die niedrigste Konzentration, bei der eine Methode mit einer statistischen Sicherheit von 1-α unterscheiden kann, ob der betreffende Analyt vorhanden ist.

(4) Bei Stoffen, die in Gruppe a des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG aufgelistet sind, muss der α-Fehler kleiner oder gleich 1 % sein. Bei allen anderen Stoffen muss der α-Fehler kleiner oder gleich 5 % sein.

Die Methoden zur Analyse von amtlichen Proben auf Stoffe in Gruppe a des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG, welche die Kriterien erfüllen, die in den Entscheidungen 90/515/EWG, 93/256/EWG und 93/257/EWG festgelegt sind, können noch für die Dauer von bis zu zwei Jahren nach Inkrafttreten dieser Entscheidung verwendet werden. Methoden, die gegenwärtig für Stoffe in Gruppe B des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG eingesetzt werden, müssen spätestens fünf Jahre nach dem Datum der Gültigkeit dieser Entscheidung den Festlegungen in dieser Entscheidung entsprechen.

1.1. Genauigkeit ist der Grad der Übereinstimmung zwischen einem Testergebnis und dem akzeptierten Referenzwert (2). Sie wird bestimmt, indem Richtigkeit und Präzision ermittelt werden.

1.2. Alpha-Fehler ist die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe negativ ist, obwohl eine positive Messung erhalten wurde ("falsch positives Ergebnis").

1.3. Ein Analyt ist der Stoff, der nachgewiesen, identifiziert und/oder quantifiziert werden muss, sowie die während seiner Analyse auftretenden Derivate.

1.4. Beta-Fehler ist die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe tatsächlich positiv ist, obwohl eine negative Messung erhalten wurde ("falsch negatives Ergebnis").

1.5. Bias ist der Unterschied zwischen der Erwartung des Testergebnisses und einem akzeptierten Referenzwert (2).

1.6. Ein Kalibrierstandard ist ein Hilfsmittel für Messungen, das die Menge des interessierenden Stoffs in einer Weise darstellt, die seinen Wert mit einer Referenzbasis in Beziehung setzt.

1.7. Zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) ist ein Material, dem ein bestimmter Analytgehalt zugeordnet worden ist.

1.8. Co-Chromatografie ist ein Verfahren, bei dem der Extrakt vor dem (den) chromatografischen Schritt(en) in zwei Teile aufgeteilt wird. Der eine Teil wird normal chromatografiert. Der zweite Teil wird mit dem zu messenden Standardanalyten gemischt. Dieses Gemisch wird dann ebenfalls chromatografiert. Die Menge an zugesetztem Standardanalyt muss etwa gleich groß wie die geschätzte Menge des Analyten im Extrakt sein. Diese Methode soll die Identifizierung eines Analyten verbessern, wenn chromatografische Methoden verwendet werden, besonders wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden kann.

1.9. Bei einer Methodenvergleichsstudie wird dieselbe Probe mit derselben Methode analysiert, um die Leistungsmerkmale der Methode zu bestimmen. Die Studie umfasst zufällige Messabweichungen und die systematische Abweichung (Bias) der beteiligten Laboratorien.

1.10. Eine Bestätigungsmethode ist eine Methode, die vollständige oder ergänzende Daten liefert, um einen Stoff eindeutig zu identifizieren und, falls erforderlich, in der interessierenden Konzentration zu quantifizieren.

1.11. Die Entscheidungsgrenze (CCα) ist der Grenzwert, bei und über dem mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von a bestimmt werden kann, dass eine Probe positiv ist.

1.12. Das Nachweisvermögen (CCβ) ist der kleinste Gehalt des Stoffs, der mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von ß in einer Probe nachgewiesen, identifiziert und/oder quantifiziert werden kann. Im Fall von Stoffen, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, ist das Nachweisvermögen die niedrigste Konzentration, bei der eine Methode in der Lage ist, tatsächlich verunreinigte Proben mit einer statistischen Sicherheit von 1 - β nachzuweisen. Im Fall von Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert bedeutet dies, dass das Nachweisvermögen die Konzentration ist, bei der die Methode zulässige Grenzkonzentrationen mit einer statistischen Sicherheit von 1 - β nachzuweisen vermag.

1.13. Dotiertes Probenmaterial ist eine Probe, die mit einer bekannten Menge des nachzuweisenden Analyten angereichert ist.

1.14. Eine Laborvergleichsuntersuchung ist die Organisation, Durchführung und Auswertung von Tests mit derselben Probe durch zwei oder mehr Laboratorien unter Einhaltung vorgegebener Bedingungen zur Bestimmung der analytischen Leistungsfähigkeit. je nach Zweck lässt sich die Untersuchung als Methodenvergleichsstudie oder als Laboreignungsprüfung klassifizieren.

1.15. Ein interner Standard (IS) ist ein nicht in der Probe enthaltener Stoff mit chemisch-physikalischen Eigenschaften, die denen des zu identifizierenden Analyten möglichst ähnlich sind, und der jeder Probe sowie jedem Kalibrierstandard zugesetzt wird.

1.16. Eine Laborprobe ist eine zum Einsenden an ein Labor vorbereitete Probe, die untersucht bzw. analysiert werden soll.

1.17. Die interessierende Konzentration ist die Konzentration des Stoffs oder Analyten in einer Probe, die wesentlich ist, um die Einhaltung der Rechtsvorschriften zu bestimmen.

1.18. Die geforderte Mindestleistungsgrenze (Minimum Required Performance Limit, MRPL) ist der Mindestgehalt eines Analyten in einer Probe, der mindestens nachgewiesen und bestätigt werden muss. Er soll die analytische Leistungsfähigkeit von Methoden für Stoffe, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, harmonisieren.

1.19. Ein Leistungsmerkmal bezeichnet eine funktionelle Qualität, die einer Analysemethode zugeschrieben werden kann. Dies kann zum Beispiel die Spezifität, Genauigkeit, Richtigkeit, Präzision, Wiederholpräzision, Reproduzierbarkeit, Wiederfindung, Nachweisvermögen oder Robustheit sein.

1.20. Leistungskriterien sind Anforderungen an ein Leistungsmerkmal, nach denen beurteilt werden kann, ob die Analysemethode für den Zweck geeignet ist und zuverlässige Ergebnisse liefert.

1.21. Ein zulässiger Grenzwert ist eine Rückstandshöchstmenge, eine maximale Konzentration oder eine sonstige maximale Toleranz für Stoffe, die an anderer Stelle in gemeinschaftlichen Rechtsvorschriften festgelegt ist.

1.22. Präzision ist der Grad der Übereinstimmung zwischen unabhängigen Testergebnissen, die unter festgesetzten (vorgegebenen) Bedingungen erzielt werden. Das Präzisionsmaß wird normalerweise als Unpräzision ausgedrückt und als Standardabweichung des Testergebnisses berechnet. Eine geringere Präzision ist durch eine größere Standardabweichung gekennzeichnet (2).

1.23. In einer Laboreignungsprüfung analysieren verschiedene Laboratorien dieselbe Probe, wobei die Laboratorien ihre eigenen Methoden wählen können, sofern diese Methoden unter Routinebedingungen eingesetzt werden. Die Prüfung muss gemäß ISO-Leitfaden 43-1 (3) und 43-2 (4) durchgeführt und kann zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit von Methoden herangezogen werden.

1.24. Eine qualitative Methode ist eine Analysemethode, die eine Substanz aufgrund ihrer chemischen, biologischen oder physikalischen Eigenschaften identifiziert.

1.25. Eine quantitative Methode ist eine Analysemethode, welche die Menge bzw. den Massenanteil eines Stoffs als Zahlenwert in geeigneten Einheiten bestimmt.

1.26. Eine Reagenzleerwertbestimmung ist die Durchführung des vollständigen Analyseverfahrens ohne Verwendung der Analysenprobe oder unter Verwendung der gleichen Menge eines geeigneten Lösungsmittels anstelle der Analysenprobe.

1.27. Die Wiederfindung ist der Prozentsatz der wahren Konzentration eines Stoffs, der beim Analysenverfahren wieder gefunden wird. Sie wird bei der Validierung bestimmt, wenn kein zertifiziertes Referenzmaterial zur Verfügung steht.

1.28. Ein Referenzmaterial ist ein Material, dessen Eigenschaft(en) mit einer validierten Methode bestätigt wurde(n), so dass es zur Kalibrierung eines Gerätes oder zur Überprüfung einer Messmethode verwendet werden kann.

1.29. Die Wiederholpräzision ist die Präzision unter Wiederholbedingungen (2).

1.30. Wiederholbedingungen sind Bedingungen, unter denen voneinander unabhängige Testergebnisse mit derselben Methode, identischem Testmaterial, in demselben Labor, durch denselben Untersucher und mit derselben Ausrüstung erzielt werden (2).

1.31. Die Reproduzierbarkeit (Vergleichspräzision) ist die Präzision unter Reproduzierbarkeitsbedingungen (2) (4).

1.32. Reproduzierbarkeitsbedingungen sind Bedingungen, unter denen Testergebnisse mit derselben Methode, identischem Testmaterial, in verschiedenen Laboratorien, durch verschiedene Untersucher und mit unterschiedlicher Ausrüstung erzielt werden (2) (4).

1.33. Robustheit ist die Anfälligkeit einer Analysemethode gegenüber Änderungen in den Versuchsbedingungen und kann ausgedrückt werden als eine Liste der Probematerialien, Analyte, Lagerungsbedingungen, Umgebungs- und/oder Probenvorbereitungsbedingungen, unter welchen die Methode wie beschrieben oder mit vorgeschriebenen geringfügigen Änderungen angewendet werden kann. Für alle Versuchsbedingungen, die in der Praxis möglicherweise schwanken können (beispielsweise Stabilität der Reagenzien, Zusammensetzung der Probe, pH-Werte, Temperatur), ist anzugeben, welche Schwankungen das Analysenergebnis beeinflussen können.

1.34. Eine Probenleerwertbestimmung ist die Durchführung des vollständigen Analyseverfahrens mit einer Analysenprobe, die den Analyten nicht enthält.

1.35. Screeningmethoden sind Methoden, die zum Nachweis des Vorhandenseins eines Stoffs oder einer Klasse von Stoffen in der interessierenden Konzentration verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen einen hohen Probendurchsatz und werden eingesetzt, um eine große Anzahl von Proben auf mögliche positive Ergebnisse zu sichten. Sie sind speziell dafür ausgelegt, falsch negative Ergebnisse zu vermeiden.

1.36. Eine laborinterne Validierungsstudie ist eine analytische Studie in einem Laboratorium unter Verwendung einer Methode zur Analyse desselben oder verschiedener Testmaterialien unter unterschiedlichen Bedingungen und über begründete lange Zeiträume.

1.37. Die Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, zwischen dem gemessenen Analyten und anderen Stoffen zu unterscheiden. Dieses Merkmal hängt vor allem vom beschriebenen Messverfahren ab, kann jedoch je nach Substanzklasse oder Matrix schwanken.

1.38. Die Standardaddition ist ein Verfahren, bei dem die Untersuchungsprobe in zwei (oder mehr) Analysenproben aufgeteilt wird. Eine Analysenprobe wird als solche analysiert, und den anderen Analysenproben werden vor der Analyse bekannte Mengen des Standardanalyten zugesetzt. Die Menge des zugesetzten Standardanalyten muss zwischen dem Zweifachen und dem Fünffachen der geschätzten Menge des Analyten in der Probe liegen. Dieses Verfahren dient dazu, den Gehalt eines Analyten in einer Probe unter Berücksichtigung der Wiederfindung des Analysenverfahrens zu bestimmen.

1.39. Ein Standardanalyt ist ein Analyt mit bekanntem und zertifiziertem Gehalt und Reinheit, der bei einer Analyse als Referenz verwendet wird.

1.40. Ein Stoff ist eine Substanz von bestimmter chemischer Struktur und ihre Metabolite.

1.41. Die Analysenprobe ist die Menge an Probenmaterial, die von der Untersuchungsprobe genommen wird, mit der die Analyse oder Beobachtung durchgeführt wird.

1.42. Eine Untersuchungsprobe ist eine aus der Laborprobe hergestellte Probe, von der Analysenproben genommen werden.

1.43. Die Richtigkeit ist der Grad der Übereinstimmung zwischen dem aus einer großen Serie von Testergebnissen ermittelten Mittelwert und einem akzeptierten Referenzwert. Die Richtigkeit wird normalerweise als systematische Abweichung (Bias) angegeben (2).

1.44. Einheiten sind die in ISO 31 (20) und in der Richtlinie 71/354/EWG beschriebenen Einheiten (19).

1.45. Validierung ist die Bestätigung durch Untersuchung und die Erbringung eines effektiven Nachweises, dass die jeweiligen Anforderungen eines bestimmten Verwendungszwecks erfüllt sind (1).

1.46. Die laborinterne Reproduzierbarkeit ist die in ein und demselben Labor unter festgesetzten (vorgegebenen) Bedingungen (betreffend z.B. die Methode, Testmaterialien, Untersucher, Umgebung) über begründete lange Zeiträume erzielte Präzision.

Analysemethoden oder Kombinationen von Methoden, die im Folgenden nicht beschrieben werden, dürfen nur dann für Screening- oder Bestätigungszwecke verwendet werden, wenn belegt werden kann, dass sie die einschlägigen Anforderungen, die in dieser Entscheidung festgelegt werden, erfüllen.

Die Proben müssen so gewonnen, gehandhabt und aufbereitet werden, dass die größtmögliche Aussicht auf einen Nachweis des Stoffs besteht. Die Verfahren der Probenhandhabung müssen die Möglichkeit einer versehentlichen Verunreinigung oder eines Analytverlusts ausschließen.

Bei der Analyse von Proben muss die Wiederfindung in jeder Probencharge bestimmt werden, wenn ein fester Wiederfindungskorrekturfaktor verwendet wird. Wenn die Wiederfindung innerhalb der vorgegebenen Grenzen liegt, kann der feste Korrekturfaktor verwendet werden. Ansonsten muss der für die betreffende Charge ermittelte Wiederfindungsfaktor verwendet werden, es sei denn der spezifische Wiederfindungsfaktor des Analyten in der Probe ist anzuwenden. In diesem Fall muss das Standardadditionsverfahren (siehe 3.5) oder ein interner Standard für die quantitative Bestimmung eines Analyten in einer Probe verwendet werden.

Eine Methode muss in der Lage sein, unter den Versuchsbedingungen zwischen dem Analyten und den anderen Stoffen zu unterscheiden. Eine Schätzung, bis zu welchem Grad dies möglich ist, muss vorgelegt werden. Es sind Strategien zur Vermeidung vorhersehbarer Störungen durch andere Substanzen bei Verwendung des beschriebenen Verfahrens, z.B. Homologa, Analoga, Stoffwechselprodukte des interessierenden Rückstands, zu ergreifen. Es ist überaus wichtig, dass eventuelle Störungen durch Matrixbestandteile untersucht werden.

Nur diejenigen Analyseverfahren, für die zurückverfolgbar belegt werden kann, dass sie validiert sind und bei der interessierenden Konzentration eine falsch negative Rate von < 5 % (β-Fehler) aufweisen, dürfen für Screeningzwecke gemäß der Richtlinie 96/23/EWG eingesetzt werden. Bei Verdacht auf ein positives Ergebnis muss dieses Ergebnis durch eine Bestätigungsmethode bestätigt werden.

Bestätigungsmethoden für organische Rückstände oder Kontaminanten müssen Aufschluss über die chemische Struktur des Analyten liefern. Folglich sind Methoden, die sich ausschließlich auf die chromatografische Analyse ohne zusätzlichen spektrometrischen Nachweis stützen, für sich allein nicht als Bestätigungsmethoden geeignet. Wenn jedoch eine Technik allein nicht spezifisch genug ist, muss die gewünschte Spezifität mit Analyseverfahren erreicht werden, die aus einer geeigneten Kombination von Clean-up, chromatografischer Trennung und spektrometrischer Detektion bestehen. Die folgenden Methoden oder Methodenkombinationen gelten als geeignet für die Identifizierung von organischen Rückständen oder Kontaminanten der angegebenen Stoffgruppen:

Tabelle 1 Geeignete Bestätigungsmethoden für organische Rückstände oder Kontaminanten

Bestätigungsmethoden sollen Aufschluss über die chemische Struktur des Analyten geben. Wenn mehrere Verbindungen das gleiche Signal liefern, kann die Methode nicht zwischen diesen Verbindungen unterscheiden. Methoden, die sich ausschließlich auf die Chromatografie ohne zusätzlichen spektrometrischen Nachweis stützen, sind allein nicht als Bestätigungsmethoden geeignet.

Bei Verwendung eines geeigneten internen Standards in einer Methode muss dieser am Anfang des Extraktionsverfahrens der Analysenprobe zugesetzt werden. je nach Verfügbarkeit werden entweder stabile isotopenmarkierte Formen des Analyten, die besonders für die massenspektrometrische Detektion geeignet sind, oder Verbindungen, die mit dem Analyten strukturell verwandt sind, verwendet.

Wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden kann, muss die Identifizierung des Analyten durch Co-Chromatografie bestätigt werden. In diesem Fall darf nur ein Peak gewonnen werden, wobei die verstärkte Peakhöhe (oder -fläche) der Menge des zugefügten Analyten entspricht. Bei der Gaschromatografie (GC) oder Flüssigchromatografie (LC) muss sich die Peakbreite bei der Hälfte der maximalen Höhe im Bereich von 90-110 % der Originalbreite bewegen, und die Retentionszeiten müssen mit einer Toleranz von 5 % identisch sein. Bei Dünnschichtchromatografie-(TLC-)Methoden muss sich nur der vermutlich durch den Analyten bedingte Fleck verstärken. Es darf kein neuer Fleck erscheinen, und auch das Erscheinungsbild darf sich nicht verändern.

Referenzmaterial oder dotiertes Material, das bekannte Analytmengen an oder nahe der zulässigen Grenze oder der Entscheidungsgrenze (positive Kontrollprobe) enthält, sowie negatives Kontrollmaterial und Reagenzleerwerte sollten vorzugsweise während des gesamten Verfahrens parallel zu jeder Serie von Untersuchungsproben analysiert werden. Die empfohlene Reihenfolge für die Injektion der Extrakte in das Analysengerät ist: Reagenzleerwert, negative Kontrollprobe, zu bestätigende Probe(n), erneute negative Kontrollprobe und schließlich die positive Kontrollprobe. Abweichungen von dieser Reihenfolge müssen begründet werden.

2.3.2. Zusätzliche Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für quantitative Analysemethoden

Bei wiederholten Analysen eines zertifizierten Referenzmaterials gelten folgende Richtbereiche für die Abweichung des experimentell bestimmten wiederfindungskorrigierten mittleren Masseanteils vom zertifizierten Wert:

Wenn keine solchen zertifizierten Referenzmaterialien zur Verfügung stehen, ist die Bestimmung der Richtigkeit der Messungen durch Wiederfindung von zugesetzten bekannten Mengen des Analyten (bzw. der Analyte) zu einer Leerwertmatrix akzeptabel. Mit der mittleren Wiederfindung korrigierte Daten sind nur dann akzeptabel, wenn sie innerhalb der Bereiche in Tabelle 2 liegen.

Bei wiederholter Analyse eines Referenzmaterials oder dotierten Materials darf der Variationskoeffizient (CV) zwischen Laboratorien unter Reproduzierbarkeitsbedingungen den mit der Horwitz-Gleichung berechneten Wert nicht überschreiten. Diese Gleichung lautet:

Dabei ist C der Massenanteil, ausgedrückt als Zehnerpotenz (Exponent) (z.B. 1 mg/g = 10^-3). Tabelle 3 zeigt Beispiele.

Tabelle 3 Beispiele für Reproduzierbarkeits-CVs für quantitative Methoden bei einem Bereich von Massenanteilen des Analyten

Bei Analysen unter Wiederholbedingungen sollte der laborinterne Variationskoeffizient typischerweise zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der obigen Werte liegen. Bei Analysen unter laborinternen Reproduzierbarkeitsbedingungen darf der laborinterne Variationskoeffizient nicht größer als der Reproduzierbarkeits-CV sein.

Bei Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert muss die Methode eine laborinterne Reproduzierbarkeit erreichen, die nicht größer als der Reproduzierbarkeits-CV bei einer Konzentration von 0,5 x der zulässige Grenzwert ist.

2.3.3. Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für den massenspektrometrischen Nachweis

Massenspektrometrische Methoden kommen nur nach chromatografischer Online- oder Offline-Trennung als Bestätigungsmethoden in Betracht.

Bei GC-MS-Verfahren muss die gaschromatografische Trennung mit Kapillarsäulen durchgeführt werden. Bei LC-MS-Verfahren muss die chromatografische Trennung mit geeigneten LC-Säulen durchgeführt werden. In jedem Fall beträgt die akzeptable Mindestretentionszeit für den untersuchten Analyten das Doppelte der Retentionszeit für das Totvolumen der Säule. Die Retentionszeit (bzw. relative Retentionszeit) des Analyten in der Analysenprobe muss derjenigen des Kalibrierstandards innerhalb eines vorgegebenen Retentionszeitfensters entsprechen. Das Retentionszeitfenster muss dem Auflösungsvermögen des Chromatografiesystems entsprechen. Das Verhältnis der chromatografischen Retentionszeit des Analyten zu der des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten, muss derjenigen der Kalibrierlösung entsprechen, bei einer Toleranz von ± 0, 5 % für die GC und ± 2,5 % für die LC.

Der massenspektrometrische Nachweis muss mit MS-Verfahren wie beispielsweise der Aufzeichnung von vollen Massenspektren (Full Scan) oder der Einzelmassenregistrierung (SIM) sowie MS-MSⁿ-Verfahren wie dem Selected Reaction Monitoring (SRM) oder anderen geeigneten MS- oder MS-MSⁿ-Verfahren in Kombination mit entsprechenden Ionisierungsarten durchgeführt werden. Bei der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) muss die Auflösung für den gesamten Massenbereich bei 10 % Tal typischerweise größer als 10 000 sein.

Full-Scan: Wenn die massenspektrometrische Bestimmung durch die Aufzeichnung von vollständigen Spektren erfolgt, ist das Vorhandensein aller gemessenen diagnostischen Ionen (Molekül-Ion, charakteristische Addukte des Molekül-Ions, charakteristische Fragment-Ionen und Isotopen-Ionen) mit einer relativen Intensität von mehr als 10 % im Referenzspektrum des Kalibrierstandards obligatorisch.

SIM: Erfolgt die massenspektrometrische Bestimmung mittels Fragmentografie, muss das Molekül-Ion vorzugsweise eines der ausgewählten diagnostischen Ionen sein (Molekül-Ion, charakteristische Addukte des MolekülIons, charakteristische Fragment-Ionen und alle ihre Isotopen-Ionen). Die gewählten diagnostischen Ionen sollten nicht ausschließlich aus demselben Teil des Moleküls stammen. Das Signal-Rausch-Verhältnis für jedes diagnostische Ion muss ≥ 3:1 sein.

Full-Scan und SIM: Die relativen Intensitäten der nachgewiesenen Ionen, ausgedrückt in Prozent der Intensität des intensivsten Ions oder Übergangs, müssen denjenigen des Kalibrierstandards entsprechen, und zwar entweder aus Kalibrierstandardlösungen oder aus dotierten Proben in vergleichbaren Konzentrationen, gemessen unter den gleichen Bedingungen innerhalb der folgenden Toleranzen:

Tabelle 4Zulässige Höchsttoleranzen für relative Ionenintensitäten bei einer Reihe von massenspektrometrischen Verfahren

Auswertung von Massenspektren: Die relativen Intensitäten der diagnostischen Ionen und/oder Vorläufer-/ Produkt-Ionenpaare müssen durch Vergleich von Spektren oder durch Integration der Signale der Einzelmassen ermittelt werden. Wenn eine Hintergrundkorrektur angewandt wird, muss diese gleichmäßig über die gesamte Probenserie angewandt (siehe 2.3.1, Absatz 4) und eindeutig angegeben werden.

Full-Scan: Wenn vollständige Spektren in einer Einzelmassenspektrometrie aufgezeichnet werden, müssen mindestens vier Ionen mit einer relativen Intensität von ≥ 10 % des Basispeaks vorhanden sein. Das Molekül-Ion sollte eingeschlossen sein, wenn es im Referenzspektrum mit einer relativen Intensität von ≥ 10 % vorhanden ist. Mindestens vier Ionen müssen innerhalb der zulässigen Höchsttoleranzen für relative Ionenintensitäten liegen (Tabelle 5). Eine computergestützte Bibliothekssuche kann durchgeführt werden. In diesem Fall muss das Ergebnis des Vergleichs der Massenspektren der Untersuchungsproben mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen Abgleichfaktor überschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung für jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die unten beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors verursacht werden können, müssen überprüft werden.

SIM: Wenn Massenfragmente nicht mit Full-Scan-Verfahren gemessen werden, muss ein System von Identifizierungspunkten zur Auswertung der Daten verwendet werden. Zur Bestätigung von Stoffen in Gruppe a des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG werden mindestens 4 Identifizierungspunkte benötigt. Zur Bestätigung von Stoffen in Gruppe B von Anhang I der Richtlinie 96/23/EG werden mindestens 3 Identifizierungspunkte benötigt. Die folgende Tabelle zeigt die Anzahl der Identifizierungspunkte, die jedes der massenspektrometrischen Basisverfahren liefern kann. Damit jedoch die für die Bestätigung erforderlichen Identifizierungspunkte vergeben und die Summe der Identifizierungspunkte berechnet werden kann, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein:

Tabelle 5Zusammenhang zwischen einer Reihe von Massenfragment-Klassen und erzielten Identifizierungspunkten

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(Stand: 31.05.2021)

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Messverfahren	Stoffe in Anhang I 96/23/EG	Einschränkungen
LC oder GC mit massenspektrometrischer Detektion	Gruppen a und B	Nur nach chromatografischer Online- oder Offline-Trennung Nur wenn Full-Scan-Verfahren verwendet werden oder mindestens 3 (Gruppe B) oder 4 (Gruppe A) Identifizierungspunkte bei Verfahren verwendet werden, die nicht die vollen Massenspektren aufzeichnen.
LC oder GC mit IR-spektrometrischer Detektion	Gruppen a und B	Spezifische Anforderungen an die Absorption bei der IR-Spektrometrie müssen erfüllt sein
LC-Full-Scan-DAD	Gruppe B	Spezifische Anforderungen an die Absorption bei der UV-Spektrometrie müssen erfüllt sein
LC - Fluoreszenz	Gruppe B	Nur für Moleküle, die eine natürliche Fluoreszenz zeigen, und
		Moleküle, die eine Fluoreszenz nach Transformation oder Derivatisierung zeigen
GC-Elektroneneinfangdetek- tion	Gruppe B	Nur, wenn zwei Säulen mit unterschiedlicher Polarität verwendet werden
LC-Immunogramm	Gruppe B	Nur, wenn mindestens zwei verschiedene Chromatografiesysteme oder eine zweite unabhängige Nachweismethode verwendet werden
LC-UV/VIS (eine Wellenlänge)	Gruppe B	Nur, wenn mindestens zwei verschiedene Chromatografiesysteme oder eine zweite unabhängige Nachweismethode verwendet werden

Massenanteil	Bereich
≤ 1 µg/kg	- 50 % bis + 20
> 1 µg/kg bis 10 µg/kg	- 30 % bis + 10
≥ 10 µg/kg	- 20 % bis + 10

Massenanteil	Reproduzierbarkeits-CV (%)
1 µg/kg	(*)
10 µg/kg	(*)
100 µg/kg	23
1 000 µg/kg (1 mg/kg)	16
(*) Für Massenanteile von weniger als 100 µg/kg liefert die Horwitz-Gleichung inakzeptabel hohe Werte. Deshalb müssen die Variationskoeffizienten (CVs) für Konzentrationen unter 100 µg/kg möglichst klein sein.

Relative Intensität (% des Basispeaks)	EI-GC-MS (relativ)	CI-GC-MS, GC-MSⁿ L C-MS, LC-MSⁿ(relativ)
>50 %	± 10 %	± 20 %
>20 %-50 %	± 15 %	± 25 %
>10 %-20 %	± 20 %	± 30 %
< 10 %	± 50 %	± 50 %

MS-Verfahren	Erzielte Identifizierungspunkte pro Ion
Niedrig auflösende Massenspektrometrie (LR-MS)	1,0
LR-MSⁿ Vorläufer-Ion	1,0
LR-MSⁿ Übergangsprodukte	1,5
HRMS	2,0
HR-MSⁿ Vorläufer-Ion	2,0
HR-MSⁿ Übergangsprodukte	2,5
Anmerkungen: (1) Jedes Ion kann nur einmal gezählt werden. (2) Die GC-MS mit Elektronenstoßionisierung gilt als ein anderes Verfahren als die GC-MS mit chemischer Ionisierung. (3) Verschiedene Analyte können nur dann verwendet werden, um die Anzahl der Identifizierungspunkte zu erhöhen, wenn die Derivate verschiedene Reagenzien verwenden. (4) Wenn für Stoffe in Gruppe a des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG die folgenden Verfahren bei der Analyse verwendet werden, können diese maximal einen Identifizierungspunkt liefern, sofern die einschlägigen Kriterien für diese Verfahren erfüllt sind: HPLC gekoppelt mit Full-Scan-Diodenarray-Spektralfotometrie (DAD), HPLC gekoppelt mit Fluoreszenzdetektion, HPLC gekoppelt mit einem Immunogramm oder zweidimensionale TLC gekoppelt mit spektrometrischem Nachweis. (5) Übergangsprodukte schließen sowohl Tochter- als auch Enkeltochter-Produkte ein.