umwelt-online: Entscheidung 2002/657/EG Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen (2)

zurück

Tabelle 6Beispiele für die Anzahl der Identifizierungspunkte für eine Reihe von Verfahren und deren Kombinationen (n = ganze Zahl)

2.3.4. Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Chromatografie gekoppelt mit Infrarotdetektion

Adäquate Peaks: Adäquate Peaks sind Absorptionsmaxima im Infrarotspektrum eines Kalibrierstandards, welche die folgenden Anforderungen erfüllen.

2.3.4.1. Infrarotdetektion

Absorptionsmaximum: Muss im Wellenzahlbereich von 4000-500 cm^-1 liegen. Absorptionsintensität: Darf nicht kleiner sein als

1. ein spezifisches molares Absorptionsmaß von 40 bezogen auf das Grundrauschen; oder
2. eine relative Absorption von 12,5 % der Absorption des intensivsten Peaks im Bereich von 4000-500 cm^-1, wenn beide bezogen auf Nullabsorption gemessen werden, und von 5 % der Absorption des intensivsten Peaks im Bereich von 4000-500 cm^-1, wenn beide bezogen auf ihr Grundrauschen gemessen werden.

Hinweis: Obwohl adäquate Peaks gemäß Buchstabe a) theoretisch vorzuziehen wären, sind in der Praxis die Peaks entsprechend Buchstabe b) leichter zu bestimmen.

Es wird die Anzahl der Peaks im Infrarotspektrum des Analyten ermittelt, deren Frequenzen denen eines adäquaten Peaks im Spektrum des Kalibrierstandards mit einer Toleranz von ± 1 cm^-1 entsprechen.

2.3.4.2. Auswertung von Infrarotspektren

Eine Absorption muss in allen Bereichen des Analytspektrums auftreten, die einem adäquaten Peak im Referenzspektrum des Kalibrierstandards entsprechen. Mindestens sechs adäquate Peaks im Infrarotspektrum des Kalibrierstandards sind erforderlich. Wenn weniger als sechs adäquate Peaks vorhanden sind (7), kann das betreffende Spektrum nicht als Referenzspektrum verwendet werden. Der "Score", d. h. der Anteil der adäquaten Peaks, der im Infrarotspektrum des Analyten gefunden wird, muss mindestens 50 betragen. Wo eine genaue Bestimmung des adäquaten Peaks nicht möglich ist, darf der entsprechende Bereich des Analytspektrums das Vorhandensein eines passenden Peaks nicht ausschließen. Das Verfahren ist nur für Absorptions-Peaks im Probenspektrum anwendbar, deren Intensität mindestens das Dreifache des Rauschens zwischen zwei Peaks beträgt.

2.3.5. Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Bestimmung eines Analyten mittels LC mit anderen Detektionsverfahren

2.3.5.1. Chromatograftsche Trennung

Ein interner Standard muss verwendet werden, wenn ein für diesen Zweck geeignetes Material zur Verfügung steht. Es muss vorzugsweise ein verwandter Standard mit einer Retentionszeit nahe der des Analyten sein. Der Analyt muss bei der Retentionszeit eluieren, die für den entsprechenden Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedingungen typisch ist. Die akzeptable Mindestretentionszeit für einen Analyten muss das Zweifache der Retentionszeit des Totvolumens der Säule betragen. Das Verhältnis der Retentionszeit des Analyten zu der des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten, muss mit einer Toleranz von ± 2,5 % mit der des Kalibrierstandards in der entsprechenden Matrix identisch sein.

2.3.5.2. Full-Scan-UV-Detektoon

Die Leistungskriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.

Die Absorptionsmaxima im Spektrum des Analyten müssen mit einer Toleranz, die durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems bestimmt wird, bei denselben Wellenlängen wie die des Kalibrierstandards liegen. Bei der Dioden-Array-Detektoon beträgt das Auflösungsvermögen typischerweise ± 2 nm. Das Analytspektrum oberhalb von 220 nm darf sich im Bereich mit einem relativen Absorptionsvermögen von ≥ 10 % optisch nicht vom Spektrum des Kalibrierstandards unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn zum einen die gleichen Maxima vorliegen und zum anderen der Unterschied zwischen den beiden Spektren an keinem Punkt mehr als 10 % des Absorptionsvermögens des Kalibrierstandards beträgt. Wenn eine computergestützte Bibliothekssuche und Anpassung durchgeführt wird, muss das Ergebnis des Vergleichs der Spektren der Untersuchungsproben mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen Abgleichfaktor überschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung für jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die oben beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors verursacht werden können, müssen überprüft werden.

2.3.5.3. Leistungskriterien für die fluorometrische Detektion

Die Leistungskriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.

Dies betrifft Moleküle, die eine natürliche Fluoreszenz aufweisen, und Moleküle, die nach Transformation oder Derivatisierung eine Fluoreszenz zeigen. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen müssen in Verbindung mit den chromatografischen Bedingungen so gewählt werden, dass das Auftreten von störenden Bestandteilen in Leerwertprobenextrakten auf ein Mindestmaß reduziert wird.

Das nächstgelegene Peakmaximum im Chromatogramm muss bei 10 % der maximalen Höhe des Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite vom festgestellten Peak des Analyten getrennt sein.

2.3.5.4. Leistungskriterien für die Bestimmung eines Analyten mit einem LC-Immunogramm

Ein LC-Immunogramm ist für sich allein nicht als Bestätigungsmethode geeignet. Die einschlägigen Kriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.

Die vorgegebenen Qualitätskontrollparameter, z.B. unspezifische Bindung, relative Bindung der Kontrollproben und der Absorptionswert der Leerwertbestimmung, müssen innerhalb der bei der Validierung des Assays ermittelten Grenzwerte liegen.

Das Immunogramm muss durch mindestens fünf Fraktionen zustande kommen. Jede Fraktion muss kleiner als die Hälfte der Peakbreite sein.

Die Fraktion mit dem höchsten Gehalt des Analyten muss für die Testprobe, die positive Kontrollprobe und den Standard die gleiche sein.

2.3.5.5. Bestimmung eines Analyten mittels LC mit UV/VIS-Detektion (eine Wellenlänge)

Die LC mit UV/VIS-Detektion (eine Wellenlänge) ist für sich allein nicht als Bestätigungsmethode geeignet. Das nächstgelegene Peakmaximum im Chromatogramm muss bei 10 % der maximalen Höhe des Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite vom festgestellten Peak des Analyten getrennt sein.

2.3.6. Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Bestimmung eines Analyten mittels 2D-TLC gekoppelt mit Full-Scan-UV/VIS-spektrometrischer Detektion

Die zweidimensionale HPTLC und die Co-Chromatografie sind obligatorisch.

Die RF-Werte des Analyten müssen mit den RF-Werten der Standards innerhalb einer Toleranz von ± 5 % übereinstimmen.

Das Erscheinungsbild des Analyten darf sich von dem des Standards nicht unterscheiden.

Bei Flecken der gleichen Farbe muss das Zentrum des Flecks, der dem Zentrum des Flecks des Analyten am nächsten liegt, von diesem mindestens die Hälfte der Summe der Fleckdurchmesser entfernt sein.

Das Spektrum des Analyten darf sich, wie für die Full-Scan-UV/VIS-Detektion beschrieben, in seinem Erscheinungsbild nicht vom Spektrum des Standards unterscheiden.

Wenn eine computergestützte Bibliothekssuche und Anpassung durchgeführt wird, muss das Ergebnis des Vergleichs der Spektren der Untersuchungsproben mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen Abgleichfaktor überschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung für jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die oben beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors verursacht werden können, müssen überprüft werden.

2.3.7. Leistungskriterien und Anforderungen für die Bestimmung eines Analyten mittels GC in Kombination mit der Elektroneneinfangdetektion (ECD)

Ein interner Standard muss verwendet werden, wenn ein für diesen Zweck geeignetes Material zur Verfügung steht. Es muss vorzugsweise ein verwandter Standard mit einer Retentionszeit nahe der des Analyten sein. Der Analyt muss bei der Retentionszeit eluieren, die für den entsprechenden Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedingungen typisch ist. Die akzeptable Mindestretentionszeit für einen Analyten muss das Zweifache der Retentionszeit des Totvolumens der Säule betragen. Das Verhältnis der Retentionszeit des Analyten zu der des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten, muss mit einer Toleranz von ± 0,5 % mit der des Kalibrierstandards in der entsprechenden Matrix identisch sein. Das nächstgelegene Peakmaximum im Chromatogramm muss bei 10 % der maximalen Höhe des Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite vom festgestellten Peak des Analyten getrennt sein. Zusätzliche Informationen können durch Co-Chromatografie gewonnen werden.

2.4. Bestätigungsmethoden für Elemente

Bestätigungsanalysen für chemische Elemente müssen auf der eindeutigen Identifizierung und der genauen und präzisen Quantifizierung mit Hilfe von chemisch-physikalischen Eigenschaften beruhen, die für das betreffende chemische Element in der interessierenden Konzentration einzigartig sind (z.B. elementcharakteristische Wellenlänge der emittierten oder absorbierten Strahlung, Atommasse).

Die folgenden Methoden oder Methodenkombinationen gelten als geeignet für die Identifizierung von chemischen Elementen:

Tabelle 7 Geeignete Bestätigungsmethoden für chemische Elemente

2.4.1. Gemeinsame Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für Bestätigungsmethoden

Referenzmaterial oder dotiertes Material, das bekannte Analytmengen an oder nahe der zulässigen Höchstmenge oder der Entscheidungsgrenze (positive Kontrollprobe) enthält, sowie negatives Kontrollmaterial und Reagenzleer werte sollten vorzugsweise während des gesamten Verfahrens parallel zu jeder Serie von Untersuchungsproben analysiert werden. Die empfohlene Reihenfolge für die Injektion der Extrakte in das Analysengerät ist: Reagenzleerwert, negative Kontrollprobe, zu bestätigende Probe, negative Kontrollprobe und schließlich die positive Kontrollprobe. Jede Abweichung von dieser Reihenfolge muss begründet werden.

Im Allgemeinen muss bei den meisten Analyseverfahren die organische Matrix vollständig aufgeschlossen werden, um vor der Bestimmung des Analyten Lösungen zu erhalten. Dazu können Mikrowellen-Mineralisationsverfahren verwendet werden, die das Risiko eines Verlustes und/oder einer Verunreinigung der interessierenden Analyte auf ein Mindestmaß reduzieren. Dekontaminierte Teflongefäße von guter Qualität müssen verwendet werden. Wenn andere Nass- oder Trockenaufschlussmethoden herangezogen werden, sollten dokumentierte Belege vorliegen, die potentielle Analytverluste oder -verunreinigungen ausschließen. Als Alternative zum Aufschluss können unter Umständen Trennverfahren (beispielsweise die Extraktion) gewählt werden, um Analyte von Matrixbestandteilen zu trennen und/oder Analyte zu konzentrieren, bevor sie dem Analysengerät zugeführt werden.

Bei der Kalibrierung, sei es extern oder anhand der Methode der Standardaddition, ist sorgfältig darauf zu achten, dass der für die Analyse festgelegte Arbeitsbereich nicht überschritten wird. Bei der externen Kalibrierung müssen die Kalibrierstandards unbedingt in einer Lösung hergestellt werden, die der Zusammensetzung der Probenlösung möglichst genau entspricht. Eine Hintergrundkorrektur muss ebenfalls angewandt werden, falls aufgrund der speziellen Gegebenheiten der Analyse erforderlich.

2.4.2. Zusätzliche Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für quantitative Analysemethoden

2.4.2.1. Richtigkeit von quantitativen Methoden

Bei wiederholten Analysen eines zertifizierten Referenzmaterials auf Elemente darf die Abweichung des experimentell bestimmten mittleren Gehalts vom zertifizierten Wert nicht außerhalb der Toleranzgrenze von ± 10 % liegen. Wenn keine solchen zertifizierten Referenzmaterialien zur Verfügung stehen, ist die Bestimmung der Richtigkeit der Messungen durch Wiederfindung von zugesetzten bekannten Mengen des Elements zu den unbekannten Proben akzeptabel. Es ist darauf hinzuweisen, dass das zugegebene Element nicht wie der Analyt in der realen Matrix chemisch gebunden ist und dass deshalb die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse weniger valide als die mit zertifizierten Referenzmaterialien gewonnenen Ergebnisse sind. Wiederfindungsdaten sind nur dann akzeptabel, wenn sie innerhalb eines Toleranzbereichs von ± 10 % um den Zielwert liegen.

2.4.2.2. Präzision von quantitativen Methoden

Bei wiederholter Analyse einer Probe unter laborinternen Reproduzierbarkeitsbedingungen darf der laborinterne Variationskoeffizient (CV) des Mittelwerts die folgenden Werte nicht überschreiten:

Tabelle 8 CVs für quantitative Methoden bei einer Reihe von Elementmassenanteilen

2.4.3. Spezifische Anforderungen für die differenzielle anodische Stripping-Pulsvoltammetrie (DPASV)

Vor einer DPASV-Bestimmung ist eine vollständige Zerstörung von organischen Stoffen von größter Bedeutung. Im Voltammogramm dürfen keine breiten Signale wegen des Vorhandenseins von organischen Stoffen auftreten. Anorganische Matrixbestandteile können die Peakhöhen bei der DPASV beeinflussen. Deshalb muss die Quantifizierung mit der Methode der Standardaddition erfolgen. Beispiele von typischen Voltammogrammen einer Probenlösung müssen der Methode beigefügt werden.

2.4.4. Spezifische Anforderungen für die Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)

Dieses Verfahren ist grundsätzlich ein Einelementverfahren und erfordert deshalb eine Optimierung der Analysenbedingungen in Abhängigkeit von dem zu quantifizierenden Element. Die Ergebnisse müssen nach Möglichkeit qualitativ und quantitativ anhand von alternativen Absorptionslinien kontrolliert werden (im Idealfall sollten zwei verschiedene Linien gewählt werden). Kalibrierstandards müssen in einer Lösungsmatrix hergestellt werden, die derjenigen der Probenmesslösung möglichst genau entspricht (z.B. in der Säurekonzentration oder der Zusammensetzung des Modifikators). Um Leerwerte auf ein Mindestmaß zu reduzieren, müssen alle Reagenzien von höchstmöglicher Reinheit sein. Je nach gewählter Methode der Verdampfung bzw. Atomisierung der Probe lassen sich verschiedene Arten der AAS unterscheiden.

2.4.4.1. Spezifische Anforderungen für die Flammen-AAS

Die empfohlenen Geräteeinstellungen müssen für jedes Element optimiert werden. Vor allem die Gaszusammensetzung und die Fließgeschwindigkeiten müssen überprüft werden. Ein Kontinuumstrahler-Korrektursystem muss verwendet werden, um Störungen durch die Hintergrundabsorption zu vermeiden. Bei unbekannten Matrices muss überprüft werden, ob eine Hintergrundkorrektur erforderlich ist.

2.4.4.2. Spezifische Anforderungen für die Graphitrohrofen-AAS

Eine Verunreinigung im Labor beeinflusst häufig die Genauigkeit bei Analysen im Ultraspurenbereich im Graphitrohrofen. Deshalb sollten hochreine Reagenzien, deionisiertes Wasser und inerte Kunststoffgeräte zur Handhabung der Proben und Reagenzien verwendet werden. Die empfohlenen Geräteeinstellungen müssen für jedes Element optimiert werden. Vor allem die Vorbehandlungs- und Atomisierungsbedingungen (Temperatur, Zeit) und die Matrixmodifikation müssen überprüft werden.

Das Arbeiten unter isothermischen Atomisierungsbedingungen (z.B. im quergeheizten Graphitrohrofen mit integrierter Lvov-Plattform (8)) verringert den Einfluss der Matrix auf die Atomisierung des Analyten. In Verbindung mit der Matrixmodifikation und der Zeeman-Hintergrundkorrektur (9) ist eine Quantifizierung anhand einer Kalibrierkurve möglich, die auf der Messung von wässrigen Standardlösungen basiert.

2.4.5. Spezifische Anforderungen für die Atomabsorptionsspektrometrie mit Hydriderzeugung

Organische Verbindungen, die Elemente wie Arsen, Wismut, Germanium, Blei, Antimon, Selen, Zinn und Tellur enthalten, können sehr stabil sein und müssen oxidativ zerlegt werden, damit korrekte Ergebnisse für den Gesamtelementgehalt gewonnen werden. Deshalb wird ein Mikrowellenaufschluss oder eine Hochdruckveraschung unter starken oxidativen Bedingungen empfohlen. Dabei sollte äußerst sorgfältig auf die vollständige und reproduzierbare Umwandlung der Elemente in ihre entsprechenden Hydride geachtet werden.

Die Bildung von Arsenhydrid in Salzsäurelösung mit NaBH4 hängt vom Oxidationszustand von Arsen ab (As III: schnelle Bildung, As V: längere Bildungszeit). Um eine Empfindlichkeitseinbuße bei der Bestimmung von As V mit der Fließinjektionstechnik aufgrund der kurzen Reaktionszeit in diesem System zu vermeiden, muss As V nach der oxidativen Zerlegung zu As III reduziert werden. Hierfür sind Kaliumiodid/Ascorbinsäure oder Cystein geeignet. Leerwert-, Kalibrier- und Probenlösungen müssen in der gleichen Weise behandelt werden. Der Einsatz eines Chargensystems ermöglicht die Bestimmung beider Arsenspezies, ohne dass die Genauigkeit beeinträchtigt wird. Aufgrund der verzögerten Bildung von As-V-Hydrid muss die Kalibrierung durch Peakflächenintegration erfolgen. Die empfohlenen Geräteeinstellungen müssen optimiert werden. Vor allem der Gasfluss, der das Hydrid in den Atomisator befördert, muss überprüft werden.

2.4.6. Spezifische Anforderungen für die Kaltdampf-Atomabsorptionsspektrometrie

Kaltdampf wird nur für die Bestimmung von Quecksilber verwendet. Aufgrund von Verflüchtigungs- und Adsorptionsverlusten von elementarem Quecksilber ist während der gesamten Analyse besondere Sorgfalt geboten. Eine Verunreinigung durch Reagenzien oder die Umgebung muss sorgfältig vermieden werden. Organische Verbindungen, die Quecksilber enthalten, müssen oxidativ zerlegt werden, damit korrekte Ergebnisse für den Gesamtquecksilbergehalt erzielt werden. Zur Zerlegung werden geschlossene Systeme mit Mikrowellenaufschluss oder Hochdruckveraschung empfohlen. Besondere Sorgfalt ist bei der Reinigung der Geräte geboten, die mit Quecksilber in Kontakt kamen.

Der Einsatz der Fließinjektionstechnik ist von Vorteil. Bei niedrigeren Entscheidungsgrenzen empfiehlt sich eine Adsorption von elementarem Quecksilber an Gold-Platinabsorber mit anschließender thermischer Desorption. Ein Kontakt des Adsorbers oder der Küvette mit Feuchtigkeit stört die Messung und muss deshalb vermieden werden.

2.4.7. Spezifische Anforderungen für die Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES)

Die Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (10) ist eine Multielementmethode zur gleichzeitigen Messung verschiedener Elemente. Für die ICP-AES müssen die Proben zunächst aufgeschlossen werden, um organische Matrices zu ersetzen. Hierfür müssen geschlossene Systeme mit Mikrowellenaufschluss oder Hochdruckveraschung verwendet werden. Für eine aussagefähige ICP-AES-Analyse spielen die Gerätekalibrierung und die Element- bzw. Wellenlängenwahl eine wesentliche Rolle. Bei der Gerätekalibrierung müssen im Fall von linearen Kalibrierkurven normalerweise Kalibrierlösungen mit nur vier Konzentrationen gemessen werden, weil ICP-AES-Kalibrierkurven im Allgemeinen über vier bis sechs Konzentrationsgrößenordnungen linear sind. Die Kalibrierung des ICP-AES-Systems sollte normalerweise mit einem Multielementstandard durchgeführt werden, der in einer Lösung hergestellt werden muss, welche die gleiche Säurekonzentration wie die Messlösung enthält. Für die lineare Kurve müssen die Elementkonzentrationen überprüft werden.

Die Wahl der Wellenlängen zur Messung der Emission der Analyte richtet sich nach den Konzentrationen der zu bestimmenden Analyte. Wenn die Analytkonzentration außerhalb des Arbeitsbereichs einer Emissionslinie liegt, muss eine andere Emissionslinie verwendet werden. Zunächst muss die empfindlichste Emissionslinie (nicht gestört) gewählt werden, dann eine weniger empfindliche Linie. Bei Analysen an oder nahe der Nachweisgrenze ist die empfindlichste Linie für den betreffenden Analyten normalerweise am besten geeignet. Spektrale Störungen und Hintergrundstörungen bereiten bei der ICP-AES die größten Schwierigkeiten. Mögliche Störungen sind z.B. die einfache Hintergrundverschiebung, die ansteigende Hintergrundverschiebung, die direkte spektrale Überlappung und die komplexe Hintergrundverschiebung. Für jede dieser Störungen gibt es bestimmte Ursachen und Abhilfemaßnahmen. )e nach den Matrices muss sowohl eine Korrektur der Störungen als auch eine Optimierung der Betriebsparameter vorgenommen werden. Einige Störungen lassen sich durch Verdünnung oder Anpassung der Matrices vermeiden. Mit jeder Serie von Untersuchungsproben müssen Referenzmaterialien und dotierte Materialien mit bekannten Analytmengen sowie Leerwertmaterial in der gleichen Weise wie die Untersuchungsproben analysiert werden. Zur Prüfung auf eine Drift muss der Standard z.B. nach 10 Proben überprüft werden. Alle Reagenzien sowie das Plasmagas müssen von höchstmöglicher Reinheit sein.

2.4.8. Spezifische Anforderungen für die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) (11)

Die Bestimmung von Spurenelementen mit durchschnittlicher Atommasse, wie zum Beispiel Chrom, Kupfer und Nickel, kann starken Störungen durch andere isobare und mehratomige Ionen unterliegen. Diese lassen sich nur vermeiden, wenn ein Auflösungsvermögen von mindestens 7000-8000 gegeben ist. Schwierigkeiten bei den MS-Verfahren sind die instrumentelle Drift, Matrixeffekte und Molekülionen-Störungen (m/z<80). Zur Korrektur der instrumentellen Drift und der Matrixeffekte ist eine mehrfache interne Standardisierung erforderlich, die denselben Massenbereich wie die zu bestimmenden Elemente abdeckt.

Vor den ICP-MS-Messungen ist eine vollständige Zersetzung von organischen Stoffen in den Proben erforderlich. Wie bei der AAS müssen flüchtige Elemente wie z.B. lod nach Aufschluss in geschlossenen Gefäßen in einen stabilen Oxidationszustand überführt werden. Sehr starke Störungen kommen durch Molekülion-Kombinationen von Argon (Plasmagas), Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff (Auflösungssäuren, Verunreinigungen des Plasmagases und mitgeschleppte Luftgase) und der Probenmatrix zustande. Zur Vermeidung von Störungen sind ein vollständiger Aufschluss, Hintergrundmessungen, eine entsprechende Wahl von analytischen Massen, die mitunter in geringerer Häufigkeit vorkommen (schlechtere Nachweisgrenze), und von Auflösungssäuren, beispielsweise Salpetersäure, erforderlich.

Für die zu bestimmenden Elemente sind Störungen durch entsprechende Wahl von spezifischen analytischen Massen einschließlich der Bestätigung von Isotopenverhältnissen auszuschließen. Das Geräteverhalten unter Berücksichtigung von Fano-Faktoren muss für jede Messung mit Hilfe von internen Standards überprüft werden.

3. Validierung

Die Validierung muss nachweisen, dass die Analysemethode die für die einschlägigen Leistungsmerkmale gültigen Kriterien erfüllt.

Unterschiedliche Kontrollzwecke erfordern verschiedene Kategorien von Methoden. Aus der folgenden Tabelle geht hervor, welche Leistungsmerkmale für welchen Methodentyp verifiziert werden müssen.

Tabelle 9 Klassifikation von Analysenmethoden nach den Leistungsmerkmalen, die bestimmt werden müssen

3.1. Validierungsverfahren

Dieses Kapitel enthält Beispiele für bzw. Verweise auf Validierungsverfahren für Analysenmethoden. Andere Ansätze zum Nachweis, dass die Analysenmethode die Leistungskriterien für Leistungsmerkmale erfüllt, können verwendet werden, sofern sie denselben Informationsgehalt liefern.

Die Validierung kann auch vorgenommen werden, indem eine Laborvergleichuntersuchung gemäß Codex Alimentarius, ISO oder IUPAC (12) durchgeführt wird, oder mit alternativen Methoden, wie zum Beispiel laborinternen Validierungsstudien (13) (14). Dieses Kapitel konzentriert sich auf die laborinterne Validierung mit einem modularen Ansatz. Dieser Ansatz umfasst:

1. eine Reihe von allgemeinen Leistungsmerkmalen, die vom verwendeten Validierungsmodell unabhängig sind, und
2. spezifischere modellabhängige Verfahren (siehe Tabelle 10).

Tabelle 10 Modellunabhängige und modellabhängige Leistungsparameter

3.1.1. Modellunabhängige Leistungsmerkmale

Unabhängig vom gewählten Validierungsansatz müssen die folgenden Leistungsmerkmale bestimmt werden. Um den Arbeitsaufwand auf ein Mindestmaß zu reduzieren, können die durchgeführten Untersuchungen sorgfältig durchdacht und statistisch fundiert kombiniert werden, um verschiedene Parameter zu bestimmen.

3.1.1.1. Spezifität

Für Analysemethoden ist das Unterscheidungsvermögen zwischen dem Analyten und eng verwandten Stoffen (Isomeren, Metaboliten, Abbauprodukten, endogenen Stoffen, Matrixbestandteilen usw.) wichtig. Zwei Ansätze sind zur Prüfung auf Störungen notwendig.

Deshalb müssen potenziell störende Substanzen ausgewählt und geeignete Leerwertproben analysiert werden, um das Vorhandensein möglicher Störungen nachzuweisen und die Auswirkung dieser Störungen abzuschätzen:

• eine Reihe von chemisch verwandten Verbindungen (Metabolite, Derivate usw.) oder andere Substanzen auswählen, die möglicherweise zusammen mit der interessierenden Verbindung, die in den Proben vorhanden sein kann, vorkommen;
• eine geeignete Anzahl an repräsentativen Leerwertproben (n ≥ 20) analysieren und in dem interessierenden Bereich, in dem die Elution des Zielanalyten zu erwarten ist, auf Störungen (Signale, Peaks, Ionenspuren) untersuchen;
• zusätzlich müssen repräsentative Leerwertproben in einer entsprechenden Konzentration mit Substanzen, welche die Identifizierung bzw. die Quantifizierung stören könnten, dotiert werden;
• nach der Analyse ist zu untersuchen, ob:
• das Vorhandensein zu einer falschen Identifizierung führen kann,
• die Identifizierung des Zielanalyten durch das Vorhandensein von einer oder mehreren Störungen beeinträchtigt wird oder
• die Quantifizierung nennenswert beeinflusst wird.

3.1.1.2. Richtigkeit

In diesem Abschnitt wird die Bestimmung der Richtigkeit (eine Komponente der Genauigkeit) beschrieben. Die Richtigkeit kann nur mit Hilfe eines zertifizierten Referenzmaterials (CRM) bestimmt werden. Ein CRM muss verwendet werden, wenn es zur Verfügung steht. Das Verfahren ist im Einzelnen in ISO 5725-4 beschrieben (5). Im Folgenden ist ein Beispiel aufgeführt:

• 6 Bestimmungen des CRM gemäß der Testvorschrift für die Methode analysieren;
• die Konzentration des Analyten in jeder der Bestimmungen ermitteln;
• den Mittelwert, die Standardabweichung und den Variationskoeffizienten (%) für diese Konzentrationen berechnen;
• die Richtigkeit berechnen, indem die gemessene mittlere Konzentration durch den zertifizierten Wert (gemessen als Konzentration) dividiert und mit 100 multipliziert und das Ergebnis als Prozentwert angegeben wird.

Richtigkeit (%) = mittlere wiederfindungskorrigierte gemessene Konzentration x 100/zertifizierter Wert.

Wenn kein CRM zur Verfügung steht, kann anstelle der Richtigkeit die Wiederfindung bestimmt werden, wie unter 4.1.2.1 weiter unten beschrieben.

3.1.1.3. Anwendbarkeit/Robustheit (kleinere Änderungen)

In solchen Studien werden gezielt geringfügige vertretbare Veränderungen durch das Labor vorgenommen und ihre Folgen beobachtet.

Vor den Untersuchungen müssen Faktoren der Probenvorbereitung, des Clean-up und der Analyse bestimmt werden, welche die Messergebnisse beeinflussen können. Solche Faktoren können der Analytiker, die Quelle und das Alter der Reagenzien, Lösungsmittel, Standards und Probenextrakte, die Heizrate, die Temperatur, der pH-Wert sowie viele weitere Faktoren sein, die im Labor vorkommen können. Diese Faktoren sollten in einer Größenordnung verändert werden, die den normalerweise zwischen Laboratorien feststellbaren Abweichungen entspricht.

• Mögliche Faktoren ermitteln, welche die Ergebnisse beeinflussen können;
• jeden Faktor leicht variieren;
• einen Robustheitstest nach der Methode von Youden durchführen (15) (16). (Hier können auch andere zulässige Methoden verwendet werden. Die Methode nach Youden beschränkt jedoch den erforderlichen Zeit- und Arbeitsaufwand auf ein Minimum.) Die Methode nach Youden ist ein gebrochenes Faktormodell. Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Faktoren können nicht festgestellt werden;
• wenn sich herausstellt, dass ein Faktor die Messergebnisse wesentlich beeinflusst, sind weitere Untersuchungen durchzuführen, um die Akzeptanzgrenzen dieses Faktors zu bestimmen;
• Faktoren, welche die Ergebnisse wesentlich beeinflussen, sollten in der Methodenvorschrift deutlich angegeben werden.

Grundsätzlich sollte aber nicht eine Veränderung nach der anderen untersucht werden, sondern es sollten mehrere Veränderungen gleichzeitig ins Spiel gebracht werden. So seien beispielsweise A, B, C, D, E, F, G die Nennwerte für sieben verschiedene Faktoren, welche die Ergebnisse beeinflussen könnten, wenn ihre Nennwerte leicht verändert werden. Ihre alternativen Werte seien die entsprechenden Kleinbuchstaben a, b, c, d, e, f und g. Dies ergibt 2⁽⁷⁾ oder 128 verschiedene mögliche Kombinationen.

Es ist nun möglich, daraus acht Kombinationen auszuwählen, in denen Groß- und Kleinbuchstaben ausgewogen verteilt sind (Tabelle 11). Acht Bestimmungen müssen durchgeführt werden, die eine Kombination der gewählten Faktoren (A-G) verwenden. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in Tabelle 11 als S-Z angegeben.

Tabelle 11Versuchsanordnung für Robustheitsstudien (geringfügige Änderungen)

3.1.1.4. Stabilität

Es ist beobachtet worden, dass eine unzureichende Stabilität des Analyten oder von Matrixbestandteilen in der Probe während der Lagerung oder Analyse zu erheblichen Abweichungen im Analysenergebnis führen kann. Des Weiteren sollte die Stabilität des Kalibrierstandards in Lösung überprüft werden. Normalerweise ist die Analytstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen gut charakterisiert. Die Überwachung der Lagerungsbedingungen ist Bestandteil des normalen Laborakkreditierungssystems. Wenn die Stabilität nicht bekannt ist, kann sie entsprechend den folgenden Beispielen bestimmt werden.

Stabilität des Analyten in Lösung

• Frische Stammlösungen des (der) Analyte(n) herstellen und gemäß den Angaben in der Testvorschrift verdünnen, um genügend Aliquots (z.B. 40) jeder gewählten Konzentration (im Bereich der geforderten Mindestleistungsgrenze bei Stoffen, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, oder im Bereich des zulässigen Grenzwerts bei anderen Stoffen) zu erhalten. Sowohl Lösungen des für die Dotierung und in der endgültigen Analyselösung verwendeten Analyten als auch sonstige interessierende Lösungen (z.B. derivatisierte Standards) herstellen;
• den Analytgehalt in der frisch hergestellten Lösung gemäß der Testvorschrift messen;
• entsprechende Volumina in geeignete Behältnisse pipettieren, etikettieren und nach folgendem Schema lagern:

  Tabelle 12 Lagerungsschema für die Bestimmung der Analgtstabilität in Lösung
  

  	- 20 °C	+ 4 °C	+ 20 °C
  Dunkel Hell	10 Aliquots	10 Aliquots	10 Aliquots 10 Aliquots

• Als Lagerungszeiten können 1, 2, 3 und 4 Wochen gewählt werden oder länger, falls erforderlich, z.B. bis die ersten Zerfallserscheinungen bei der Identifizierung bzw. Quantifizierung zu beobachten sind. Die maximale Lagerungszeit und die optimalen Lagerungsbedingungen müssen dokumentiert werden.
• Die Konzentration des (der) Analyte(n) in jedem Aliquot sollte berechnet werden, indem die zum Zeitpunkt der Analyse frisch hergestellte Lösung des Analyten als 100 % angenommen wird.

Restanalyt (%) = C_i x 100/C_frisch

Ci =	Konzentration zum Zeitpunkt
Cfrisch=	Konzentration der frischen Lösung

Stabilität des Analyten in Matrix

• Nach Möglichkeit sollten eingesandte Proben verwendet werden. Wenn kein eingesandtes Material verfügbar ist, sollte mit dem Analyten dotierte Matrix verwendet werden.
• Wenn eingesandtes Material zur Verfügung steht, sollte die Konzentration in diesem Material bestimmt werden, solange das Material noch frisch ist. Die Konzentration in weiteren Aliquots des Materials könnte nach 1, 2, 4 und 20 Wochen bestimmt werden. Das Gewebe sollte bei mindestens minus 20 °C gelagert werden, falls erforderlich, auch bei niedrigeren Temperaturen.
• Wenn kein eingesandtes Material verfügbar ist, sollte etwas Leerwertmaterial homogenisiert werden. Das Material in 5 Aliquots aufteilen. Jedes Aliquot mit dem Analyten dotieren, der vorzugsweise in einer geringen Menge wässriger Lösung zubereitet werden sollte. Ein Aliquot sofort analysieren. Die restlichen Aliquots bei mindestens minus 20 °C oder, falls erforderlich, auch bei niedrigeren Temperaturen lagern und nach 1, 2, 4 und 20 Wochen analysieren.

weiter .