umwelt-online: AVV Fleischhygiene (3)

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1.6.2 Untersuchung

Von jeder der nach Anlage 1 Kapitel III Nr. 1.2 bis 1.4 F1HV entnommenen Proben sind je Tier (Hausschwein) 14 etwa haferkorngroße Stückchen aus verschiedenen Stellen möglichst am Übergang vom muskulösen in den sehnigen Teil auszuschneiden und zwischen den Gläsern des Kompressoriums so zu quetschen, dass durch die Präparate Druckschrift normaler Größe gelesen werden kann. Bei der Untersuchung von Wildschweinen sind aus den vorgeschriebenen Proben jeweils 28 etwa haferkorngroße Stückchen zu entnehmen und entsprechend Satz 1 zu untersuchen. Präparate von angetrocknetem Fleisch sind vor dem Quetschen mindestens 10 Minuten lang mit Kalilauge aufzuweichen, die mit etwa der doppelten Menge Wasser verdünnt ist.

Die Untersuchung mit dem Trichinoskop hat so zu erfolgen, dass jedes Präparat langsam und sorgfältig durchmustert wird. Ergeben sich bei der Untersuchung mit dem Trichinoskop verdächtige Stellen, deren Natur auch mit Hilfe der starken Vergrößerung des Trichinoskops nicht sicher festzustellen ist, so sind sie mit dem Mikroskop nachzuprüfen.

Die mikroskopische Untersuchung hat so zu erfolgen, dass jedes Präparat bei 30 bis 40 facher Vergrößerung langsam und sorgfältig durchmustert wird.

Bei zweifelhaftem Befund ist die Untersuchung mit einer der unter Nummer 1.5 genannten Methoden der künstlichen Verdauung zu wiederholen.

2 Bakterioskopische Untersuchung

2.1 Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode beschreibt ein mikroskopisches Verfahren zur Abschätzung der Keimbelastung und -verteilung auf oder in Fleisch und Fleischerzeugnissen anhand eines gefärbten Abdruckpräparates. Die Methode erlaubt nur eine grobe Abschätzung der mikrobiellen Belastung des Untersuchungsmaterials. Eine Unterscheidung zwischen vermehrungsfähigen und abgetöteten Keimen ist nicht möglich.

2.2 Kurzbeschreibung

Flächen (Oberflächen, Bohrlinge oder Schnittflächen) des Untersuchungsmaterials werden auf einem Objektträger abgedrückt. Das dabei übertragene Material wird einer Bakterienfärbung unterzogen und anschließend mikroskopisch untersucht. Außer Bakterien werden mit diesem Verfahren auch Hefen und Schimmelpilze nachgewiesen.

2.3 Chemikalien

2.3.1 Chemikalien für die Bakterienfärbung nach Gram;

2.3.2 Ethanol oder Spiritus 95 % ⁴;

2.3.3 Isopropanol 70 % ⁴;

2.3.4 Diethylether p.a. ⁸.

2.4 Geräte und Hilfsmittel

Die für die Probennahme benötigten Geräte müssen vor Verwendung sorgfältig gereinigt und desinfiziert werden.

2.4.1 Skalpell, gerade Schere und Pinzette;

2.4.2 Becherglas, Neunvolumen 100 ml, mit Deckel, zum Bereithalten von Ethanol;

2.4.3 Becherglas, Nennvolumen 100 ml, mit Deckel, zum Auffangen von abtropfendem Diethylether;

2.4.4 Tropfpipette;

2.4.5 Glas-Objektträger;

2.4.6 Binokulares Durchlichtmikroskop mit Beleuchtungseinrichtung und 1000 facher Vergrößerung (bei Ölimmersion);

2.4.7 Immersionsöl für die Mikroskopie;

2.4.8 Färbevorrichtung (Färbebank, Färbegefäße, Objektträgerpinzetten);

2.4.9 Bunsenbrenner;

2.4.10 Zellstoff, steril, ungebleicht.

2.5 Untersuchungsmaterial

2.5.1 Unverpacktes Untersuchungsgut

Je nach Untersuchungsziel wird ein Abdruckpräparat von der Oberfläche oder von einem aus der Tiefe entnommenen Probenteil angefertigt.

2.5.2 Untersuchungsgut in luftdicht verschlossenen Behältnissen Die Oberfläche des Behältnisses wird unmittelbar vor Untersuchungsbeginn mit Ethanol- oder spiritusgetränktem Zellstoff gereinigt und bei hitzeresistentem Verpackungsmaterial durch Abflammen mit Ethanol oder Spiritus an der Stelle, an der das Behältnis geöffnet werden soll, keimfrei gemacht. Falls die Art des Verpackungsmaterials dies nicht zuläßt (z.B. bei Kunststofffolie), wird ein mit Isopropanol getränktes Zellstofftuch für einige Minuten auf die entsprechende Stelle der Behältnisoberfläche gelegt.

Sofern Öffnungsvorrichtungen (Schraubverschluß, Aufreißclip) nicht vorhanden sind, ist zum Öffnen je nach Verpackungsmaterial ein keimfrei gemachter Dosenöffner oder eine keimfrei gemachte Schere zu verwenden.

Es sind Oberflächen- und Tiefenproben zu entnehmen.

2.5.2.1 Oberflächenprobe

Bei luftdicht verschlossenen Dosen ist Material am Übergang zur Längsnaht (Deckelbördelung) oder am Übergang von der Längsnaht oder - verschweißung zur Dosenbördelung, bei Folienverpackung an der Querversiegelung zu entnehmen.

2.5.2.2 Tiefenprobe

Es ist Material aus dem geometrischen Mittelpunkt des Füllgutes (Kern) zu entnehmen.

2.6 Durchführung

Mit sterilen Entnahmegeräten werden von der Oberfläche der zu untersuchenden Probe Würfel mit einer Kantenlänge von 1 cm herausgeschnitten und mit der von der Probenoberfläche stammenden Würfelseite auf dem Objektträger abgedruckt; alternativ kann ein Objektträger direkt auf den zu untersuchenden Oberflächenteil des Probenwürfels gelegt und kurz angepresst werden.

Vor der Entnahme von Material aus der Tiefe der Probe ist die Oberfläche des Füllgutes zur Vermeidung einer Verschleppung von Keimen in die Tiefe kurz und kräftig abzuflammen (Bräunung bis etwa 2 mm Tiefe). Mit sterilen Entnahmegeräten wird an der erforderlichen Stelle Material entnommen und auf einem Objektträger abgedruckt.

Die Entnahmegeräte sind bei jeder Probe zu wechseln. Während der Entnahme von Unterproben von derselben Probe ist eine Zwischendesinfektion in Ethanol oder Spiritus mit anschließendem Abflammen des Alkohols nach jeder Unterprobe ausreichend.

Die Abdruckpräparate werden 60 Minuten bei Zimmertemperatur luftgetrocknet oder 30 Minuten im Brutschrank bei 30 °C hitzefixiert. Anschließend werden sie über einem Becherglas vorsichtig dreimal durch Auftropfen von Diethylether auf das Präparat entfettet. Nach völliger Abtrocknung wird das auf die Objektträger übernommene Untersuchungsmaterial durch dreimaliges langsames Durchziehen durch die , "kalte" Flamme eines Brenners hitzefixiert und die Bakterienfärbung durchgeführt. Dabei ist zu beachten, dass gegenüber Ausstrichpräparaten die Abdruckpräparate meist ein geringeres Haftungsvermögen auf dem Objektträger aufweisen. Daher ist eine schonende Färbung auf einer Färbebank zu empfehlen.

Die Färbung nach Gram erfolgt nach Laborvorschrift.

Nach Abschluss der Färbung wird das Präparat unter dem Mikroskop bei 1000 facher Vergrößerung (mit Ölimmersion) und einer Sehfeldzahl von 18 bis 22 untersucht. Die Überprüfung auf das Vorhandensein gramnegativer Keime ist besonders sorgfältig vorzunehmen, da von einer störenden Rotfärbung des Untergrundes durch das Untersuchungsgut auszugehen ist.

Der präparierte Objektträger ist - sofern er nicht zu Vergleichszwecken vorübergehend aufgehoben wird - wie infektiöses Material zu behandeln und entsprechend zu entsorgen.

2.7 Auswertung

Es wird die Anzahl der pro Gesichtsfeld nachgewiesenen Mikroorganismen (arithmetisches Mittel aus 20 Gesichtsfeldern) in folgender Abstufung angegeben:

Bei vollständig haltbar gemachten Fleischerzeugnissen in luftdicht verschlossenen Behältnissen ist in den Fällen, in denen in 20 Gesichtsfeldern (bezogen auf eine Sehfeldzahl von 20) insgesamt mehr als 30 Keime nachgewiesen werden, eine kulturelle Untersuchung durchzuführen. Diese erfolgt nach fünftägiger Bebrütung eines noch luftdicht verschlossenen Behältnisses bei 37 °C und anschließender zwölfstündiger Lagerung bei etwa 4 °C nach den unter Nummer 4.8 (anaerober Keimgehalt) und gegebenenfalls Nummer 4.4 (aerober Keimgehalt) genannten Verfahren.

2.8 Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Methode mindestens anzugeben:

• Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;
• Art und Datum der Probenahme;
• Eingangs- und Untersuchungsdatum;
• Untersuchungsergebnis;
• Begründung, falls von dieser Methode abgewichen wurde.

3 Histologische Untersuchung

Die geweblich-substanzielle Zusammensetzung von Fleischerzeugnissen kann anhand der charakteristischen Struktur und Anfärbbarkeit der verarbeiteten Gewebselemente identifiziert werden. Auf die Methode L 06.00-13 "Bestimmung der geweblichen Zusammensetzung von Fleisch, Fleischerzeugnissen und Wurstwaren (Routineverfahren zur qualitativen und quantitativen histologischen Untersuchung)" der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren zu § 35 LMBG wird hingewiesen.

4 Bakteriologische Untersuchung (BU)

4.1 Zweck und Anwendungsbereich

4.1.1 Die Bakteriologische Untersuchung ,dient, abgesehen von den in Anlage 1 Kapitel III Nr. 3.3 FlHV genannten Fällen, als Hilfsmittel zur Beurteilung von Einzeltieren im Rahmen der Fleischuntersuchung. Zur Sicherstellung einer sachgerechten Durchführung der Untersuchungen und der Aussagekraft der Ergebnisse ist in besonderem Maße auf die entsprechende Entnahme des Probenmaterials und die Einhaltung der Kühlkette während der Lagerung und des Transports zu achten.

4.1.2 Im Antrag auf Durchführung einer Bakteriologischen Untersuchung sollten alle zweckdienlichen Angaben (z.B. pathologische Veränderungen) und gegebenenfalls zusätzliche Untersuchungsziele (z.B. Rotlauf) angegeben werden.

Dieser Antrag erfasst auch die Durchführung von Rückstandsuntersuchungen nach Nummer 5.

4.1.3 Es werden Methoden beschrieben, die zur semiquantitativen Bestimmung des sonstigen Keimgehaltes sowie zum qualitativen Nachweis von Rotlauf-Erregern, Salmonellen und obligat anaeroben grampositiven Stäbchen (Clostridien) geeignet sind. Zur Untersuchung auf Milzbrand wird auf die Arbeitsanleitung zur Labordiagnostik von anzeigepflichtigen Tierseuchen (BAnz. Nr. 172a vom 12.09.2000) verwiesen.

4.1.4 Die Anwendung anderer als der unter den Nummern 4.4 bis 4.7 beschriebenen Nachweisverfahren oder die Verwendung anderer als der dort genannten Nährmedien ist nur dann zulässig, wenn deren Gleichwertigkeit durch geeignete Vergleichsuntersuchungen sichergestellt ist. Anstelle der dort genannten Nährmedien können auch hinreichend erprobte im Handel erhältliche Systeme eingesetzt werden.

Die Anwendung anderer Nachweisverfahren oder die Verwendung anderer Nährmedien muss dokumentiert werden.

4.2 Auswahl, Entnahme und Versand der Proben

4.2.1 Zur Durchführung der Bakteriologischen Untersuchung, ausgenommen bei Geflügel und Federwild, sind folgende Proben zu entnehmen:

4.2.1.1 aus der Muskulatur der Vorder- oder Hinterextremität einer Tierkörperhälfte ein ganzer, von Faszien umhüllter Muskelbauch oder ein zusammenhängendes Muskelstück (von ca. 6 bis 8 cm Seitenlänge) aus dem Bereich der Untergliedmaßen. Liegen diese nicht in entsprechender Größe vor, ist ein anderer Muskel, z.B. aus der Adduktorengruppe im Bereich der Beckensymphyse ("Fleischspiegel") zu wählen;

4.2.1.2 aus der anderen Tierkörperhälfte der Bug- oder der große innere Darmbeinlymphknoten mit dem umhüllenden Fett- oder Bindegewebe;

4.2.1.3 die Milz, bei großen Schlachttieren oder bei erheblicher Schwellung ein handgroßes Stück;

4.2.1.4 eine Niere;

4.2.1.5 ein faustgroßes Stück Lebergewebe aus dem Bereich der Leberpforte oder der Spigelsche Lappen mit der Leberpforte oder bei kleineren Tieren die ganze Leber.

4.2.1.6 Als Zusatzproben sind fallweise zu entnehmen:

4.2.1.6.1 veränderte Teile (z.B. Herz oder Herzklappen bei Rotlaufverdacht), gegebenenfalls mit dazugehörigen Lymphknoten je nach erhobenem Verdacht;

4.2.1.6.2 bei Tieren aus Salmonellen-Ausscheiderbeständen ⁹, die selbst bisher nicht als Ausscheider in Erscheinung getreten sind, sowie bei Tieren, die zur Serum- und Impfstoffgewinnung gedient haben, ein ca. 10 cm langes Dünndarmstück mit den dazugehörigen Lymphknoten.

4.2.2 Zur Durchführung der Bakteriologischen Untersuchung bei Geflügel und Federwild erfolgt die Probenahme nach Anlage 1 Kapitel IV Nr. 6 und 7 GFlHV entsprechend dem Untersuchungsziel.

4.2.3 Die Entnahme der Proben hat mit abgeflammten oder mit durch sonstige Hitze entkeimten Instrumenten zu erfolgen. Lymphknoten und Niere sollen möglichst nicht angeschnitten werden. Proben, bei denen nicht innerhalb einer Stunde mit der Untersuchung begonnen werden kann, sind vor der Umverpackung durchzukühlen, jedoch nicht einzufrieren.

Die einzeln in flüssigkeitsundurchlässigem Material verpackten Proben sind auslaufsicher zu verpacken und danach in einem wärmeisolierten Transportbehältnis mit geeignetem Füllmaterial zu umgeben.

Der Versand ist ohne Verzug und auf dem schnellsten Wege durchzuführen. Es ,ist zu gewährleisten, dass in den Proben eine Temperatur von 10 °C nicht überschritten wird. Die Transportgefäße müssen erforderlichenfalls mit zusätzlichen Vorrichtungen zur Kältespeicherung (Kühlelemente) beschickt sein.

4.2.4 Der Antrag auf Bakteriologische Untersuchung ist so beizufügen, dass er nicht verunreinigt wird.

Auf einen besonderen Verdacht, insbesondere auf Milzbrand oder Rotlauf, ist neben der Angabe im Antrag zusätzlich und leicht lesbar auf einem Packzettel hinzuweisen; dieser Packzettel ist so beizufügen, daß er beim Öffnen des Transportbehältnisses nicht übersehen werden kann.

4.2.5 Aufbewahrung des der Bakteriologischen Untersuchung unterliegenden Tierkörpers und Fleisches

Der Tierkörper, bei dem eine Bakteriologische Untersuchung eingeleitet worden ist, ist mit allen Organen und sonstigen Teilen bis zum Abschluss der Untersuchungen vorläufig zu beschlagnahmen und so aufzubewahren, dass ein Berühren des Fleisches durch Unberufene und insbesondere eine mittelbare oder unmittelbare Berührung mit anderem Fleisch oder anderen Lebensmitteln verhindert wird.

Der Tierkörper oder das Fleisch ist während dieser Zeit luftig und kühl aufzubewahren. Organe und sonstige Teile des Tierkörpers, die untauglich für den menschlichen Genuß bzw. von der Beurteilung ausgenommen sind, können vor Abschluss der Bakteriologischen Untersuchung beseitigt werden, sofern sie für Probenahmen nicht aufbewahrt werden müssen.

4.3 Vorbereitung der Proben

Bei einem vom Einsender geäußerten Verdacht auf Milzbrand oder Rotlauf sind entsprechende Sicherheitsmaßnahmen zu beachten.

Die zu untersuchenden Teilproben sind aus der Tiefe der eingesandten Gesamtproben zu entnehmen. Hierzu ist zunächst anhaften - des Binde- und Fettgewebe zu entfernen und anschließend die Oberfläche des zur Entnahme der Teilprobe vorgesehenen Bereiches - bei kleinen Proben, wie Lymphknoten, die gesamte Oberfläche - durch Hitze bis zu einer Tiefe von 1 bis 2 mm sichtbar zu denaturieren. Danach werden mit keimfrei gemachter Schere und Pinzette jeweils etwa haselnussgroße Teilproben entnommen und nach den im Folgenden beschriebenen Verfahren verwendet.

Beim Ausstrich auf verschiedene Nährbodenplatten kann diese Teilprobe wiederholt verwendet werden; es ist jedoch jeweils ein neuer Anschnitt vorzunehmen.

4.4 Direktes Ausstrichverfahren auf festen Nährmedien zur semiquantitativen Bestimmung des sonstigen Keimgehalts

4.4.1 Nährmedium

Es wird mindestens ein einfacher Standard-Nährboden (z.B. Pepton-Fleischextrakt-Agar) verwendet, der als handelsüblicher Fertignährboden erworben oder nach üblicher Laboratoriumspraxis hergestellt wird. Die verwendeten Platten sollten einen Durchmesser von etwa 10 cm haben. Ergänzend kann ein Dextrose-Blut-Agar oder ein anderer hinreichend erprobter im Handel erhältlicher fester Nährboden mit Blutzusatz eingesetzt werden.

4.4.2 Die nach Nummer 4.3.2 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber werden mit jeweils frischen Anschnitten auf jeweils mindestens einer halben Nährbodenplatte, die Teilprobe aus der Muskulatur auf einer ganzen Nährbodenplatte nach Nummer 4.4.1 - jeweils unter Ausnutzung der verfügbaren Fläche - ausgestrichen.

Die beimpften Nährbodenplatten sind bei 37 °C ± 1 °C für mindestens 18 Stunden zu bebrüten. Nährböden mit Blutzusatz sind weitere 24 Stunden zu bebrüten.

4.4.3 Auswertung

Vor der Auswertung ist durch kritischen Vergleich aller angelegten Platten zunächst ein sekundärer Keimgehalt oder die Penetrationsflora von unsachgemäß angelieferten Proben auszuschließen. Letzteres ist bei der Mitteilung des Befundes zu berücksichtigen. Sofern nicht starker Keimgehalt den Nachweis langsamer wachsender Keime überdeckt, werden Nährböden mit Blutzusatz nach weiteren 24 Stunden Bebrütung erneut ausgewertet. Das relevante Keimwachstum wird als

• keimfrei (keine Kolonienbildung),
• schwach keimhaltig (bis zu 20 koloniebildende Einheiten) oder
• stark keimhaltig (mehr als 20 koloniebildende Einheiten) bewertet und im Untersuchungsbericht vermerkt.

Die Untersuchungsstelle hat ferner mitzuteilen, ob aufgrund des Bakteriologischen Gesamtbefundes bei dem betreffenden Schlachttier zur Zeit der Schlachtung ein Einbruch von Bakterien in die Blutbahn und somit in den ganzen Tierkörper als Folge einer Erkrankung vorgelegen hat ("Bakteriämie"). Sie hat auch mitzuteilen, wenn anzunehmen ist, dass ein starker Keimgehalt einzelner Proben auf eine Verunreinigung oder eine Penetration von Oberflächenkeimen (Einfluss der Beförderungsart und -dauer, unsachgemäße Probengröße oder Verpackung etc.) zurückzuführen ist.

4.5 Untersuchungen auf Rotlauf

4.5.1 Nährmedien

4.5.1.1 Natriumazid-Bouillon nachfolgender Zusammensetzung

Die Lösung wird gut vermischt, auf einen pH-Wert von 7,8 ± 0,1 eingestellt, zu je 5 ml in Röhrchen abgefüllt und zweimal fraktioniert sterilisiert.

Als Grundlage kann auch eine andere laborübliche Nährbouillon mit einem Zusatz von 0,5 g Natriumazid je 1000 ml verwendet werden. Als weiterer Zusatz kann Kanamycin eingesetzt werden.

4.5.1.2 Blut-Agar-Platten mit Zusatz von 1 % Glucose

4.5.2 Anreicherungsverfahren

Von den nach Nummer 4.3 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber sowie gegebenenfalls von weiterem eingesandten Probenmaterial (z.B. Herzklappen oder Herzmuskulatur) werden etwa bohnengroße Stückchen in eine Natriumazid-Bouillon nach Nummer 4.5.1.1 gegeben. Die Bebrütung dieser Anreicherung erfolgt für 18 bis 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C. Daran anschließend wird aus dieser Anreicherung je eine halbe Platte des Nährbodens nach Nummer 4.5.1.2 beimpft.

4.5.3 Direktausstrich

Die nach Nummer 4.3 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber sowie gegebenenfalls weiteres eingesandtes Probenmaterial werden mit jeweils frischen Anschnitten zusätzlich auf jeweils mindestens einer halben Platte des Nährbodens nach Nummer 4.5.1.2 - jeweils unter Ausnutzung der verfügbaren Fläche - ausgestrichen.

4.5.4 Die nach Nummer 4.5.2 oder Nummer 4.5.3 beimpften Nährbodenplatten werden bei 37 °C ± 1 °C bebrütet; sie werden nach 24 Stunden und gegebenenfalls erneut nach 48 Stunden auf das Vorkommen von feinen, hämolysierenden Kolonien geprüft.

Von verdächtigen Kolonien wird ein Objektträgerausstrich angefertigt, nach Gram gefärbt (vgl. Nummer 2.6) und mikroskopisch auf das Vorliegen charakteristischer Zellstrukturen untersucht.

4.6 Untersuchungen auf Salmonellen

4.6.1 Nährmedien und Seren

4.6.1.1 Anreicherungsmedien

4.6.1.1.1 Peptonwasser, gepuffert;

4.6.1.1.2 Tetrathionat-Bouillon:

4.6.1.1.3 Selenit-Bouillon;

4.6.1.1.4 Anreicherungsmedium nach Rappaport-Vassiliadis;

4.6.1.2 Feste Selektivnährböden

4.6.1.2.1 Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-Saccharose-Agar;

4.6.1.2.2 eine weitere Selektiv-Indikatorplatte für Salmonellen nach Laboratoriumspraxis.

4.6.2 Untersuchung auf Salmonellen im Anreicherungsverfahren

4.6.2.1 In ein Gefäß mit 100 ml Anreicherungsflüssigkeit nach Nummer 4.6.1.1.2 oder Nummer 4.6.1.1.3 oder einem anderen Anreicherungsmedium nach jeweils neuestem wissenschaftlichen Erkenntnisstand werden Mengen von ca. 2 g aus jeder der unter Nummer 4.1.2 genannten Teilproben eines Tierkörpers nach grober Vorzerkleinerung mit der Schere zu einer Sammelanreicherung zusammengefügt. Die Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei 37 °C ± 1 °C zu bebrüten.

Falls die Untersuchung von zusätzlich eingesandten Proben (Verdachtsproben oder Proben von Tieren aus Ausscheiderbeständen oder von Serum- und Impfstofftieren) notwendig wird, ist eine zweite Anreicherung nur mit diesen Proben anzusetzen.

4.6.2.2 Handelt es sich bei den zu untersuchenden Proben um gefrorene, getrocknete oder in irgendeiner Form zubereitete Proben, z.B. bei der Einfuhruntersuchung, ist eine Voranreicherung in 100 ml gepuffertem Pepton-Wasser (Nummer 4.6.1.1.1) für mindestens 6 Stunden bei 37 °C ± 1 °C vorzuschalten; aus dieser wird ein Inokulum von 10 ml in die selektive Anreicherung entsprechend Nummer 4.6.2.1 übertragen. Diese Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei 37 °C ± 1 °C zu bebrüten.

Im Fall der Voranreicherung von Proben kann an Stelle der Tetrathionat- oder Selenitbouillon auch das Anreicherungsmedium nach Rappaport-Vassiliadis (Nummer 4.6.1.1.41 verwendet werden. Dann sind jedoch nur 0,1 ml der bebrüteten Voranreicherung in 10 ml dieses Mediums zu übertragen. Diese Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei 42 °C ±1 °C zu bebrüten.

4.6.2.3 Im Anschluss an die unter Nummer 4.6.2.1 bzw. Nummer 4.6.2.2 genannte Bebrütung ist eine Subkultivierung vorzunehmen. Zu diesem Zweck werden mit einer Pipette vier Tropfen der Anreicherung auf eine erste Selektivplatte gebracht und sofort ausgespatelt. Der gleiche Spatel wird zur Beimpfung einer weiteren nach Nummer 4.6.1.2.2 ausgewählten Selektivplatte benutzt. Die Bebrütung des Plattensatzes erfolgt für 18 Stunden bei 37 °C ± 1°C.

4.6.3 Auswertung

4.6.3.1 Nach Beendigung der Bebrütungszeit sind die nach Nummer 4.2.2.3 aus der Anreicherung angelegten Subkultur-Platten auf das Wachstum von verdächtigen Kolonien zu untersuchen. Zur weiteren Abklärung sind fallweise serologische oder biochemische Verfahren oder die Phagentypisierung einzusetzen.

4.6.3.2 Nicht vollständig ausdifferenzierte, aber als Salmonellen erkannte Stämme, sowie der betreffende Stamm in einem unklar bleibenden Fall, sind zwecks Ermittlung des Salmonellen-Serotyps an ein anerkanntes Referenzlaboratorium für Salmonellen zu senden.

4.6.3.3 Kann bei der serologischen Prüfung der Salmonellen-Serotyps eindeutig ermittelt werden, wird dieser Befund im Untersuchungsbericht angegeben und dem Einsender mitgeteilt.

Bei allen nicht vollständig ausdifferenzierten, aber als Salmonellen erkannten Stämmen kann die Diagnose "Salmonellen nachgewiesen" gestellt und dem Einsender mitgeteilt werden. Das gleiche gilt für den Fall, dass sich bei der Prüfung des biochemischen Verhaltens die für Salmonellen typischen Reaktionen ergeben.

Sofern ein Stamm zur Ermittlung des Salmonellen-Serotyps an ein anerkanntes Referenzlaboratorium gesandt worden ist, wird dessen endgültige Diagnose in den eigenen Unterlagen vermerkt und dem Einsender nachträglich übermittelt.

4.7 Untersuchungen auf obligat anaerob wachsende grampositive Stäbchen (Clostridien)

4.7.1 Nährmedien

4.7.1.1 Leberbrühe nach Kelch oder Leber-Leber-Bouillon oder Hirn-Herz-Bouillon. Alternativ können auch andere vergleichbare flüssige Nährmedien verwendet werden (vgl. Nummer 4.1.4).

Das Nährmedium wird zu je 10 ml in Reagenzgläser gefüllt und bereits bei der Herstellung mit einem geeigneten luftabdichtenden Pfropfen (z.B. Paraffingemisch schüttfähig/flüssig im Verhältnis 2:1) versehen. Unmittelbar vor der Verwendung wird das Nährmedium zum Sieden gebracht.

4.7.1.2 Dextrose-Blut-Agar oder ein anderer hinreichend erprobter im Handel erhältlicher fester Nährboden

4.7.2 Herstellen eines anaeroben Milieus

Anaerobes Milieu wird durch das Zuführen eines Gasgemisches von 90 % N₂ + 10 % CO₂ in einem evakuierbaren Gefäß hergestellt. Das Gefäß sollte einmalig gespült werden, indem es mit dem Gasgemisch gefüllt, evakuiert und erneut mit dem Gasgemisch gefüllt wird. Die Anaerobiose kann in Anaerobiertöpfen auch chemischkatalytisch mit geeigneten im Handel erhältlichen Sets herbeigeführt werden.

4.7.3 Bei pathomorphologischem Verdacht auf das Vorliegen einer Clostridien-Infektion ist ein direkter Ausstrich auf einer Nährbodenplatte nach Nummer 4.7.1.2 anzulegen und diese anaerob nach einem der unter Nummer 4.7.2 genannten Verfahren bei 37 °C ± 1 °C für etwa 24 Stunden zu bebrüten.

4.7.4 Entsprechend dem unter Nummer 4.3 beschriebenen Verfahren wird eine bohnengroße Probe aus der Tiefe der Muskulatur entnommen und in ein Röhrchen mit siedend heißer Leberbrühe (oder einem anderen Nährmedium) eingegeben. Dabei ist die luftabdichtende Paraffinschicht schnell zu durchstoßen. Die Bebrütung erfolgt für mindestens 18 Stunden bei 37 °C ± 1 °C.

4.7.5 Bei einer durch deutliche Lageveränderung des luftabschließenden Paraffinpfropfens erkennbaren Gasbildung ist wie folgt zu verfahren:

4.7.5.1 Aus dem Inhalt eines jeden Röhrchens mit erkennbarer Gasbildung wird ein Objektträgerausstrich angefertigt, nach Gram gefärbt (vgl. Nummer 2.6) und mikroskopisch durchmustert. Dazu wird das betroffene Röhrchen über dem Bunsenbrenner unter Schräghaltung so erhitzt, dass der Paraffinpfropfen teilweise verflüssigt und die Bouillonkultur zugänglich wird. Werden ausschließlich oder überwiegend gramnegative, nicht sporenbildende Stäbchen oder Kokken festgestellt, ist die Untersuchung beendet und das Ergebnis als negativ zu bezeichnen.

4.7.5.2 Bei Nachweis von grampositiven oder gramlabilen Stäbchen ohne oder mit Sporenbildung oder von gramnegativen Stäbchen mit Sporenbildungstendenz erfolgt die Anlage einer Subkultur, indem je ein Tropfen der fraglichen Flüssigkultur auf zwei festen Nährböden nach Nummer 4.7.1.2 gleichmäßig mit Öse oder Spatel ausgestrichen wird.

Die beimpften Platten werden bei 37 °C ± 1 °C für etwa 24 Stunden bebrütet; dabei wird eine Platte aerob, die andere anaerob nach einem der unter Nummer 4.7.2 genannten Verfahren gehalten.

4.7.5.3 Auswertung des Direktausstriches und der Subkulturen

Die Direktausstriche nach Nummer 4.7.3 werden auf das Vorliegen verdächtiger Kolonien geprüft. Von diesen sind Ausstriche zu fertigen, nach Gram zu färben und mikroskopisch auf das Vorliegen grampositiver oder gramlabiler Stäbchen mit oder ohne Sporenbildung zu prüfen.

Nach der Bebrütung der Subkulturen folgt eine vergleichende Bewertung des Wachstums auf den beiden parallel angelegten Nährböden zur Feststellung eventuell vorhandener obligat anaerober Keimflora-Anteile. Von solchen Anteilen einer Mischkultur werden Ausstrichpräparate in ausreichender Zahl, mindestens von je drei Kolonien, gefertigt, nach Gram gefärbt und mikroskopisch auf das Vorliegen grampositiver oder gramlabiler Stäbchen mit oder ohne Sporenbildung geprüft.

Entsprechend dem Ausgang dieser mikroskopischen Untersuchung wird das Ergebnis im Untersuchungsbericht unter Nennung der Art der Kultivierung (Direktausstrich oder über Anreicherung) als "positiv" oder "negativ" angegeben.

4.7.5.4 Bei Verdacht auf toxinogene Spezies oder Bakteriämieerreger sind weitere Identifizierungsversuche einzuleiten.

4.8 Sofern Krankheitserreger gefunden worden sind, hat die Untersuchungsstelle dieses Ergebnis auf dem schnellsten Wege vorab (ggf. fernmündlich, mit Fernschreiber oder Telefax) und außerdem noch schriftlich der im Antragsvordruck bezeichneten Stelle mitzuteilen. Dies gilt auch für den Fall, dass solche Bakterien zwar nicht nachgewiesen sind, aber den Umständen nach (z.B. Fehlen wichtiger Organe, Eingang nicht mehr verwertbaren Probenmaterials oder bei örtlichem Milzbrand des Schweines) das Freisein des Tierkörpers von solchen Keimen trotzdem nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann. Ein Exemplar des ausgefüllten Vordruckes ist mindestens drei Jahre aufzubewahren.

weiter .