umwelt-online: VO(EG) Nr. 152/2009 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (4)

zurück

.

A. Bestimmung des Gehalts an freiem und Gesamtgossypol

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol, Gesamtgossypol und chemisch verwandten Substanzen in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat sowie in Mischfuttermitteln, die diese Futtermittel-Ausgangsstoffe enthalten, sofern mehr als 20 mg/kg an freiem Gossypol, Gesamtgossypol und chemisch verwandten Substanzen vorhanden sind.

2. Prinzip

Gossypol wird in Gegenwart von 3-Amino-1-Propanol entweder mit einer Isopropanol-Hexan-Mischung (zur Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol) oder mit Dimethylformamid (zur Bestimmung des Gesamtgossypolgehalts) extrahiert und mittels Anilin zu Gossypoldianilin umgesetzt, dessen Extinktion bei 440 nm gemessen wird.

3. Reagenzien

3.1 Isopropanol-Hexan-Mischung: Isopropanol (Volumenanteil = 60 %) wird mit n-Hexan (Volumenanteil = 40 % gemischt.

3.2 Lösungsmittel A: In einen 1-l-Messkolben werden ca. 500 ml Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1), 2 ml 3-Amino-1-Propanol, 8 ml Eisessig und 50 ml Wasser gegeben, und es wird mit Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz ist 1 Woche lang haltbar.

3.3 Lösungsmittel B: In einen 100-ml-Messkolben werden 2 ml 3-Amino-1-Propanol und 10 ml Eisessig pipettiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit N, N-Dimethylformamid zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz ist 1 Woche lang haltbar.

3.4 Anilin: Wenn die Extinktion im Blindversuch 0,022 überschreitet, ist das Anilin über Zinkstaub unter Verwerfung der ersten und der letzten 10 % des Destillats zu destillieren. In einem braunen, geschlossenen Gefäß ist dieses Reagenz im Kühlschrank einige Monate haltbar.

3.5 Gossypol-Standardlösung A: In einen 250-ml-Messkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mit Lösungsmittel a ( 3.2) gelöst. Dann wird mit Lösungsmittel a ( 3.2) zur Marke aufgefüllt. Von dieser Lösung werden 50 ml in einen 250-ml-Messkolben pipettiert, und es wird mit Lösungsmittel a ( 3.2) zur Marke aufgefüllt. Die Gossypol-Konzentration dieser Lösung beträgt 0,02 mg/ml. Vor Gebrauch 1 h lang bei Raumtemperatur stehen lassen.

3.6 Gossypol-Standardlösung B: In einen 50-ml-Messkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mit Lösungsmittel B ( 3.3) gelöst. Dann wird mit Lösungsmittel B ( 3.3) zur Marke aufgefüllt. Die Gossypol-Konzentration dieser Lösung beträgt 0,5 mg/ml.

Die Standard-Gossypol-Lösungen a und B sind vor Lichteinwirkung geschützt 24 h lang haltbar.

4. Geräte

4.1 Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 min^-1.

4.2 Spektralfotometer.

5. Verfahren

5.1 Einwaage

Die Menge der Einwaage richtet sich nach dem vermuteten Gehalt an Gossypol in der Probe. Dabei sollte vorzugsweise mit einer geringen Einwaage und einem relativ großen aliquoten Teil des Filtrats gearbeitet werden, um genügend Gossypol für eine genaue fotometrische Messung zu erhalten. Für die Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat darf höchstens 1 g eingewogen werden; bei Mischfuttermitteln bis zu 5 gn. Ein aliquoter Teil des Filtrats von 10 ml ist in den meisten Fällen geeignet; er muss 50 bis 100 µg Gossypol enthalten. Für die Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol muss 0,5 bis 5 g eingewogen werden, so dass in einem aliquoten Teil des Filtrats von 2 ml 40 bis 200 µg Gossypol enthalten sind.

Die Analyse ist bei einer Raumtemperatur von etwa 20 °C auszuführen.

5.2 Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol

Die Einwaage wird in einen 250-ml-Kolben mit Schliffhals, dessen Boden mit Glassplittern bedeckt ist, überführt. Mit Hilfe einer Pipette werden 50 ml des Lösungsmittels a ( 3.2) hinzugegeben. Anschließend wird der Kolben verschlossen und 1 h lang im Schüttelgerät geschüttelt. Dann wird durch einen trockenen Filter filtriert und das Filtrat in einem kleinen Kolben mit Schliffhals aufgefangen. Während der Filtration wird der Trichter mit einem Uhrglas bedeckt.

Es werden gleich große aliquote Teile des Filtrats, die 50 bis 100 µg Gossypol enthalten, in 2 25-ml-Messkolben (a und B) pipettiert und gegebenenfalls mit Lösungsmittel a ( 3.2) auf 10 ml aufgefüllt. Dann wird der Inhalt des Kolbens (A) mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Probenlösung verwendet.

Danach werden je 10 ml des Lösungsmittels a ( 3.2) in 2 weitere 25-ml-Messkolben (C und D) pipettiert. Der Inhalt des Kolbens (C) wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Blindprobenlösung verwendet.

Zu den Messkolben (D) und (B) werden je 2 ml Anilin ( 3.4) zugegeben. Die Kolben werden dann 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) jeweils zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen.

Dann werden im Spektralfotometer bei 440 nm unter Verwendung von 1-cm-Glasküvetten die Extinktion der Blindprobe (D) im Vergleich mit der Vergleichslösung (C) und die Extinktion der Probenlösung (B) im Vergleich mit der Vergleichslösung (A) gemessen.

Die Extinktion der Blindprobenlösung wird von der Extinktion der Probenlösung subtrahiert (= korrigierte Extinktion). Anhand des so ermittelten Werts wird der Gehalt an freiem Gossypol, wie unter 6 angegeben, berechnet.

5.3 Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol

Eine Einwaage, die 1 bis 5 mg Gossypol enthält, wird in einen 50-ml-Messkolben gegeben; dann werden 10 ml des Lösungsmittels B ( 3.3) hinzugefügt. Gleichzeitig wird ein Blindversuch mit 10 ml des Lösungsmittels B ( 3.3) in einem anderen 50-ml-Messkolben vorbereitet. Beide Messkolben werden 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) jeweils zur Marke aufgefüllt. Es wird geschüttelt, 10 bis 15 min stehen gelassen, dann filtriert und das Filtrat in Kolben mit Schliffhals aufgefangen.

Es werden jeweils 2 ml des Filtrats der Probe in 2 25-ml-Messkolben und jeweils 2 ml des Filtrats des Blindversuchs in 2 andere 25-ml-Messkolben pipettiert. Je 1 Kolben jeder Versuchsreihe wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) auf 25 ml aufgefüllt. Diese Lösungen werden als Vergleichslösungen verwendet.

Zu den beiden anderen Messkolben werden je 2 ml Anilin ( 3.4) hinzugefügt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) auf jeweils 25 ml aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen.

Die Extinktionen werden, wie unter 5.2 für freies Gossypol angegeben, gemessen. Anhand des so ermittelten Werts wird der Gehalt an Gesamtgossypol, wie unter 6 angegeben, berechnet.

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Berechnung der Ergebnisse kann anhand der spezifischen Extinktion ( 6.1) oder anhand einer Kalibrationskurve ( 6.2) erfolgen.

6.1 Anhand der spezifischen Extinktion

Die spezifischen Extinktionen berechnen sich unter den beschriebenen Bedingungen wie folgt:

Der Gehalt an freiem bzw. an Gesamtgossypol der Probe wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

E = korrigierte Extinktion, ermittelt gemäß 5.2,
p = Einwaage in g,
a = aliquoter Teil des Filtrats in ml.

6.2 Anhand einer Kalibrationskurve

6.2.1 Freies Gossypol

Es werden 2 Reihen von je 5 25-ml-Messkolben vorbereitet. In beide Reihen werden jeweils 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 bzw. 10,0 der Gossypol-Standardlösung a ( 3.5) pipettiert; das Volumen wird mit dem Lösungsmittel a ( 3.2) auf 10 ml aufgefüllt. Jeder Reihe wird ein weiterer 25-ml-Messkolben hinzugefügt, der nur 10 ml des Lösungsmittels a ( 3.2) enthält (Blindversuch).

Die Kolben der ersten Reihe einschließlich des Kolbens für den Blindversuch werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) auf 25 ml aufgefüllt (Vergleichsreihe).

Den Kolben der zweiten Reihe, einschließlich des Blindversuchs, werden jeweils 2 ml Anilin ( 3.4) zugesetzt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe).

Die Extinktion der Lösungen der Standardreihe wird gemäß 5.2 durch einen Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe ermittelt. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Gossypolmenge (in µg) auf der Abszisse aufgetragen werden.

6.2.2 Gesamtgossypol

Es werden 6 50-ml-Messkolben vorbereitet. In den ersten werden 10 ml des Lösungsmittels B ( 3.3) und in die übrigen je 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 bzw. 10,0 ml der Gossypol-Standardlösung B ( 3.6) pipettiert. Der Inhalt eines jeden Kolbens wird mit dem Lösungsmittel B ( 3.3) auf 10 ml aufgefüllt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt und geschüttelt.

In 2 Reihen von je 6 25-ml Messkolben werden jeweils 2,0 ml dieser Lösung pipettiert. Die Kolben der ersten Reihe werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) auf 25 ml aufgefüllt. (Vergleichsreihe).

Den Kolben der zweiten Reihe werden jeweils 2 ml Anilin ( 3.4) zugesetzt. Dann werden sie 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung ( 3.1) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe).

Die Extinktion der Lösungen der Standardreihe wird gemäß 5.2 durch einen Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe ermittelt. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Gossypolmenge (in µg) auf der Abszisse aufgetragen werden.

6.3 Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• 15 % relativ zum höheren Wert bei Gossypol-Gehalten unter 500 ppm,
• 75 ppm absolut bei Gossypol-Gehalten zwischen 500 und 750 ppm,
• 10 % relativ zum höheren Wert bei Gossypol-Gehalten über 750 ppm.

B. Bestimmung des Gehalts an Dioxinen (PCDD/PCDF) UND PCB^{14 17}

Kapitel I
Probenahmeverfahren und Auswertung von Analyseergebnissen

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Proben für die amtliche Untersuchung des Gehalts an polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen (PCDD), polychlorierten Dibenzofuranen (PCDF) sowie dioxinähnlichen polychlorierten Biphenylen (PCB) ¹ und nicht dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln werden nach den in Anhang I beschriebenen Verfahren genommen. Hinsichtlich der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die in Futtermitteln gleichmäßig verteilt sind, gelten die quantitativen Anforderungen gemäß Anhang I Nummer 5.1. Die mit diesem Verfahren gewonnenen Sammelproben sind als repräsentativ für die betreffenden Partien oder Teilpartien anzusehen. Anhand der bei den Laborproben bestimmten Gehalte wird festgestellt, ob die in der Richtlinie 2002/32/EG festgesetzten Höchstgehalte eingehalten wurden.

Für die Zwecke dieses Teils B gelten die Begriffsbestimmungen in Anhang I der Entscheidung 2002/657/EG der Kommission ².

Darüber hinaus gelten für die Zwecke dieses Teils B folgende Begriffsbestimmungen:

"Screening-Verfahren" sind Verfahren, die zur Auswahl derjenigen Proben genutzt werden, deren Gehalt an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB die Höchstgehalte oder die Aktionsgrenzwerte überschreitet. Sie müssen auf kostengünstige Weise einen hohen Probendurchsatz erlauben, was die Chancen erhöht, neue Vorfälle mit hoher Exposition und Gesundheitsgefahren für die Verbraucher aufzudecken. Screening-Verfahren beruhen auf bioanalytischen oder GC-MS-Verfahren. Ergebnisse von Proben, in denen der Cut-off-Wert für die Überprüfung der Konformität mit dem Höchstgehalt überschritten wird, sind durch eine erneute vollständige Analyse der ursprünglichen Probe mittels eines Bestätigungsverfahrens zu überprüfen.

"Bestätigungsverfahren" sind Verfahren, die vollständige oder ergänzende Daten liefern, mit denen die PCDD/F und dioxinähnlichen PCB am Höchstgehalt oder erforderlichenfalls am Aktionsgrenzwert eindeutig identifiziert und quantifiziert werden können. Bei diesen Verfahren kommen Gaschromatografie/hochauflösende Massenspektrometrie (GC-HRMS) oder Gaschromatografie/Tandem-Massenspektrometrie (GC-MS/MS) zum Einsatz.

2. Übereinstimmung der Partie bzw. Teilpartie mit den Anforderungen in Bezug auf die Höchstgehalte

2.1. Nicht dioxinähnliche PCB

Die Partie oder Teilpartie entspricht den Anforderungen in Bezug auf den Höchstgehalt, wenn das Ergebnis der Untersuchung für die Summe von PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 und PCB 180 (im Folgenden "nicht dioxinähnliche PCB") den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt unter Berücksichtigung der Messunsicherheit nicht überschreitet ³. Die Partie oder Teilpartie entspricht dem Höchstgehalt gemäß der Richtlinie 2002/32/EG nicht, wenn das Mittel der durch Zweitanalyse ⁴ ermittelten Obergrenzen ("upper-bound ⁵") zweier Untersuchungsergebnisse unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit den Höchstgehalt zweifelsfrei überschreitet, d. h. zur Beurteilung, ob die Höchstgehalte eingehalten werden, wird die gemessene Konzentration nach Abzug der erweiterten Messungenauigkeit herangezogen.

Die erweiterte Messunsicherheit wird mithilfe eines Erweiterungsfaktors von 2 berechnet, der zu einem Grad des Vertrauens von ca. 95 % führt. Eine Partie oder Teilpartie entspricht nicht den Vorgaben, wenn das Mittel der gemessenen Werte abzüglich der erweiterten Messunsicherheit des Mittels über dem Höchstgehalt liegt.

Die in den oben stehenden Absätzen unter dieser Nummer genannten Bestimmungen gelten für das Untersuchungsergebnis der für die amtliche Kontrolle entnommenen Probe. Im Falle einer Analyse für Rechtfertigungs- oder Referenzzwecke gelten die einzelstaatlichen Bestimmungen.

2.2. Für PCDD/F und dioxinähnliche PCB

Die Partie oder Teilpartie entspricht den Anforderungen in Bezug auf die Höchstgehalte, wenn das Ergebnis einer einzelnen Untersuchung,

• durchgeführt mit einem Screening-Verfahren, dessen Falsch-negativ-Rate unter 5 % liegt, ergibt, dass der Wert den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt für PCDD/F und für die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB nicht überschreitet;
• durchgeführt mit einem Bestätigungsverfahren, den in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalt für PCDD/F und für die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit nicht überschreitet.

Für Screening-Assays ist ein Cut-off-Wert festzulegen, anhand dessen entschieden wird, ob eine Probe den jeweiligen Höchstgehalten für PCDD/F bzw. die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB entspricht.

Die Partie oder Teilpartie entspricht den Anforderungen in Bezug auf den Höchstgehalt gemäß der Richtlinie 2002/32/EG nicht, wenn das Mittel der durch Zweitanalyse ⁶ mit einem Bestätigungsverfahren ermittelten Obergrenzen ("upper-bound ⁷") zweier Untersuchungsergebnisse unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit den Höchstgehalt zweifelsfrei überschreitet, d. h., zur Beurteilung, ob die Höchstgehalte eingehalten werden, wird die gemessene Konzentration nach Abzug der erweiterten Messungenauigkeit herangezogen.

Die erweiterte Messunsicherheit wird mithilfe eines Erweiterungsfaktors von 2 berechnet, der zu einem Grad des Vertrauens von ca. 95 % führt. Eine Partie oder Teilpartie entspricht nicht den Vorgaben, wenn das Mittel der gemessenen Werte abzüglich der erweiterten Messunsicherheit des Mittels über dem Höchstgehalt liegt.

Die Summe der geschätzten erweiterten Messunsicherheiten der getrennten Analyseergebnisse der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB ist für die Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB zu verwenden.

Die in den oben stehenden Absätzen unter dieser Nummer genannten Bestimmungen gelten für das Untersuchungsergebnis der für die amtliche Kontrolle entnommenen Probe. Im Falle einer Analyse für Rechtfertigungs- oder Referenzwecke gelten die einzelstaatlichen Bestimmungen.

3. Ergebnisse, die die Aktionsgrenzwerte gemäß Anhang II der Richtlinie 2002/32/EG überschreiten

Aktionsgrenzwerte dienen als Instrument zur Auswahl der Proben in Fällen, in denen eine Kontaminationsquelle gefunden wird und Maßnahmen zu deren Eindämmung oder Beseitigung getroffen werden müssen. Durch Screening-Verfahren sind die geeigneten Cut-off-Werte für die Auswahl dieser Proben festzulegen. Wenn die Bestimmung einer Kontaminationsquelle und deren Eindämmung oder Beseitigung erhebliche Anstrengungen erfordert, ist es angezeigt, die Überschreitung der Aktionsgrenzwerte durch eine Zweitanalyse im Bestätigungsverfahren und unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit zu bestätigen ⁸.

Kapitel II
Probenvorbereitung und Anforderungen an Untersuchungsverfahren zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an Dioxinen (PCDD/F) und dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln

1. Anwendungsbereich

Die in diesem Kapitel beschriebenen Anforderungen gelten, wenn Futtermittel zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an 2,3,7,8-substituierten PCDD/F und dioxinähnlichen PCB sowie für die Probenvorbereitung und Untersuchungsanforderungen zu anderen regulatorischen Zwecken, darunter die Kontrollen der Futtermittelunternehmer zur Gewährleistung der Vorschriftsmäßigkeit gemäß der Verordnung (EG) Nr. 183/2005 des Europäischen Parlaments und des Rates ⁹, untersucht werden.

Die Überwachung von Futtermitteln auf Vorhandensein von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB kann mit zwei unterschiedlichen Verfahrensarten erfolgen:

1. Screening-Verfahren
2. Ziel der Screening-Verfahren ist die Auswahl derjenigen Proben, deren Gehalt an PCCD/F und dioxinähnlichen PCB die Höchstgehalte oder die Aktionsgrenzwerte überschreitet. Screening-Verfahren sollen auf kostengünstige Weise einen hohen Probendurchsatz erlauben, was die Chancen erhöht, neue Vorfälle mit hoher Exposition und Gesundheitsgefahren für die Verbraucher aufzudecken. Ihre Anwendung hat insbesondere die Vermeidung falsch-negativer Ergebnisse zum Ziel. Sie können bioanalytische und GC-MS-Verfahren umfassen.
3. Bei Screening-Verfahren wird das Analyseergebnis mit einem Cut-off-Wert verglichen und angegeben, ob der Höchstgehalt oder Aktionsgrenzwert möglicherweise überschritten wird oder nicht. Die Konzentration von PCDD/F und der Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in Proben, in denen eine Überschreitung des Höchstgehalts vermutet wird, muss durch ein Bestätigungsverfahren ermittelt oder bestätigt werden.
4. Darüber hinaus können Screening-Verfahren Hinweise auf den in der Probe vorhandenen Gehalt an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB liefern. Bei bioanalytischen Screening-Verfahren wird das Ergebnis in bioanalytischen Äquivalenten (BEQ) und bei physikalisch-chemischen GC-MS-Verfahren in Toxizitätsäquivalenten (TEQ) ausgedrückt. Die in Zahlen ausgedrückten Ergebnisse von Screening-Verfahren sind geeignet, die Konformität bzw. die vermutete Nichtkonformität oder das Überschreiten von Aktionsgrenzwerten anzuzeigen und weisen außerdem für den Fall einer Weiterverfolgung mittels Bestätigungsverfahren auf die Gehaltsbereiche hin. Sie sind nicht für Zwecke wie die Bewertung von Hintergrundgehalten, die Schätzung der Aufnahme, die Verfolgung der zeitlichen Entwicklung von Gehalten oder die Neubewertung von Aktionsgrenzwerten und Höchstgehalten geeignet.
5. Bestätigungsverfahren
6. Bestätigungsverfahren ermöglichen die eindeutige Identifizierung und Quantifizierung von in einer Probe vorhandenen PCDD/F und dioxinähnlichen PCB und liefern vollständige Informationen auf Kongenerenebene. Sie erlauben somit die Kontrolle von Höchstgehalten und Aktionsgrenzwerten, einschließlich der Bestätigung von mittels Screening-Verfahren erzielten Ergebnissen. Außerdem können die Ergebnisse für weitere Zwecke genutzt werden, wie die Bestimmung der Belastung im niedrigen Hintergrundbereich bei der Futtermittelüberwachung, die Verfolgung der zeitlichen Entwicklung, die Expositionsbewertung und für den Aufbau einer Datenbank im Hinblick auf eine mögliche Neubewertung der Aktionsgrenzwerte und Höchstgehalte. Sie sind außerdem bei der Feststellung von Kongeneren-Mustern zur Bestimmung der Quelle einer möglichen Kontamination von Bedeutung. Solche Verfahren verwenden GC-HRMS. Zur Bestätigung der Konformität oder Nichtkonformität mit dem Höchstgehalt kann auch die GC-MS/MS verwendet werden.

2. Hintergrund

Zur Berechnung der TEQ-Konzentrationen werden die Konzentrationen der einzelnen Substanzen in einer bestimmten Probe mit den jeweiligen Toxizitätsäquivalenzfaktoren (TEF) (siehe Fußnote 1 in Kapitel I) multipliziert und dann addiert, woraus sich die Gesamtkonzentration an dioxinähnlichen Verbindungen, ausgedrückt in TEQ, ergibt.

Für die Zwecke dieses Teils B entspricht die akzeptierte spezifische Bestimmungsgrenze eines einzelnen Kongeners dem niedrigsten Analytgehalt, der sich mit angemessener statistischer Zuverlässigkeit quantifizieren lässt und die Identifizierungskriterien erfüllt, wie sie in international anerkannten Normen, z.B. in der Norm EN 16215:2012 (Futtermittel - Bestimmung von Dioxinen und dioxinähnlichen PCB mittels GC-HRMS und von Indikator-PCB mittels GC-HRMS) und/oder in den überarbeiteten EPA-Methoden 1613 und 1668, beschrieben sind.

Die Bestimmungsgrenze eines einzelnen Kongeners lässt sich bestimmen als

1. die Konzentration eines Analyten in einem Probenextrakt, die ein Signal des Messgeräts bei zwei verschiedenen Ionen hervorruft, die mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 bei dem weniger empfindlichen Rohdatensignal verbunden sind; oder
2. wenn die Signal-Rausch-Berechnung aus technischen Gründen keine zuverlässigen Ergebnisse ergibt, der niedrigste Konzentrationspunkt auf einer Kalibrierkurve, der eine annehmbare (≤ 30 %) und konsistente (Messung mindestens zu Beginn und am Ende einer analytischen Probensequenz) Abweichung vom mittleren relativen Responsefaktor aufweist, der bei jeder Probensequenz für alle Punkte auf der Kalibrierkurve berechnet wurde. Die Bestimmungsgrenze wird auf der Grundlage des niedrigsten Konzentrationspunktes unter Berücksichtigung der Wiederfindung interner Standards und der Probeneinwaage berechnet.

Mit bioanalytischen Methoden erhält man kein Ergebnis auf Ebene der Kongeneren, sondern lediglich einen Hinweis ¹⁰ auf den TEQ-Gehalt, der in BEQ ausgedrückt wird, wodurch der Tatsache Rechnung getragen wird, dass möglicherweise nicht alle in einem Probenextrakt vorliegenden Verbindungen, die ein Signal erzeugen, allen Voraussetzungen des TEQ-Prinzips genügen.

Screening- und Bestätigungsverfahren können nur dann zur Kontrolle einer bestimmten Matrix verwendet werden, wenn sie empfindlich genug sind, Gehalte im Bereich der Aktionsgrenzwerte oder Höchstgehalte zuverlässig zu bestimmen.

3. Anforderungen an die Qualitätssicherung

3.1. Auf jeder Stufe des Probenahme- und Analyseverfahrens sind Maßnahmen zur Vermeidung von Kreuzkontamination zu treffen.

3.2. Die Proben sind in hierfür geeigneten Glas-, Aluminium-, Polypropylen- oder Polyethylen-Behältnissen zu lagern und zu transportieren, sodass der Gehalt der Proben an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB nicht verfälscht wird. Spuren von Papierstaub sind vom Probenbehälter zu entfernen.

3.3. Lagerung und Transport der Proben haben so zu erfolgen, dass die Futtermittelprobe unversehrt erhalten bleibt.

3.4. Sofern zutreffend, sind die einzelnen Laborproben mithilfe eines Verfahrens, mit dem nachweislich eine vollständige Homogenisierung erreicht wird, fein zu mahlen und gründlich zu mischen (z.B. so fein gemahlen, dass die Probe durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm passt). Falls die Proben einen zu hohen Feuchtigkeitsgehalt aufweisen, sind sie vor dem Mahlen zu trocknen.

3.5. Die Reagenzien, Glasgeräte und die weitere Ausrüstung sind auf Faktoren, die möglicherweise die TEQ- und BEQ-basierten Ergebnisse verfälschen könnten, zu kontrollieren.

3.6. Es ist eine Methodenleerwert-Untersuchung durchzuführen, bei der das gesamte Analyseverfahren durchgeführt und nur die Probe weggelassen wird.

3.7. Bei Anwendung bioanalytischer Methoden ist zu überprüfen, dass sämtliche Glasgeräte und Lösungsmittel, die bei der Analyse verwendet werden, frei von Verbindungen sind, die die Erkennung der Zielverbindungen im Arbeitsbereich beeinträchtigen könnten. Glasgeräte sind mit Lösungsmitteln zu spülen oder auf Temperaturen zu erhitzen, die geeignet sind, alle Spuren von PCDD/F, dioxinähnlichen Verbindungen und interferierenden Verbindungen von der Oberfläche der Geräte zu entfernen.

3.8. Die Menge der für die Extraktion verwendeten Probe muss ausreichend groß sein, um die Anforderungen hinsichtlich eines ausreichend niedrigen Arbeitsbereichs, der den Konzentrationsbereich der Höchstgehalte oder Aktionsgrenzwerte beinhaltet, zu erfüllen.

3.9. Zur spezifischen Vorbereitung der Proben der zu untersuchenden Erzeugnisse sind Verfahren gemäß international anerkannten Leitlinien zu verwenden.

4. Anforderungen an Laboratorien

4.1. Gemäß den Bestimmungen der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 müssen die Laboratorien von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein, die nach ISO Guide 58 arbeitet, damit sichergestellt ist, dass die Laboratorien bei der Untersuchung Qualitätssicherungsverfahren anwenden. Die Laboratorien müssen gemäß der Norm EN ISO/IEC 17025 akkreditiert sein. Falls zutreffend, ist den in den technischen Leitlinien für die Schätzung der Messunsicherheit und der Bestimmungsgrenzen für die Untersuchung auf PCDD/F und PCB beschriebenen Grundsätzen zu folgen ¹¹.

4.2. Die Laborleistung ist durch die kontinuierliche erfolgreiche Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zur Ermittlung des Gehalts an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in den entsprechenden Futtermittelmatrices und Konzentrationsbereichen unter Beweis zu stellen.

4.3. Laboratorien, die zur Routinekontrolle von Proben Screening-Verfahren verwenden, müssen eng mit Laboratorien zusammenarbeiten, die Bestätigungsverfahren anwenden, sowohl zur Qualitätssicherung als auch zur Bestätigung der Ergebnisse verdächtiger Proben.

5. Grundlegende Anforderungen an Verfahren zur Untersuchung auf Dioxine (PCDD/F) und dioxinähnliche PCB

5.1. Niedriger Arbeitsbereich und niedrige Bestimmungsgrenzen

Bei PCDD/F müssen die nachweisbaren Mengen wegen der extrem hohen Toxizität einiger dieser Verbindungen im oberen Femtogramm-Bereich (10^{- 15}g) liegen. Bei den meisten PCB-Kongeneren ist eine Bestimmungsgrenze im Bereich Nanogramm (10^{- 9}g) bereits ausreichend. Zur Messung der toxischeren dioxinähnlichen PCB-Kongenere (insbesondere der nonorthosubstituierten Kongenere) muss das untere Ende des Arbeitsbereichs bis in den unteren Pikogramm-Bereich (10^{- 12}g) reichen. Bei allen anderen PCB-Kongeneren ist eine Bestimmungsgrenze im Nanogramm-Bereich (10^{- 9}g) ausreichend.

5.2.Hohe Selektivität (Spezifizität)

5.2.1. PCDD/F und dioxinähnliche PCB müssen von einer Vielzahl anderer, gemeinsam extrahierter und möglicherweise interferierender Verbindungen unterschieden werden, die in Konzentrationen von bis zu mehreren Größenordnungen höher als diejenigen der interessierenden Analyten vorhanden sind. Bei GC-MS-Verfahren ist eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Kongeneren erforderlich, beispielsweise zwischen toxischen (z.B. die siebzehn 2,3,7,8-substituierten PCDD/F sowie die zwölf dioxinähnlichen PCB) und anderen Kongeneren.

5.2.2. Bioanalytische Methoden müssen einen Nachweis der Zielverbindungen als Summe der PCDD/F und/oder dioxinähnlichen PCB ermöglichen. Ziel der Probenaufreinigung muss sein, Verbindungen, die falsch-positive Ergebnisse verursachen könnten oder Verbindungen, die das Signal schwächen und dadurch falsch-negative Ergebnisse verursachen könnten, zu entfernen.

5.3.Hohe Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision, beobachtete Bioassay-Wiederfindung)

5.3.1. Bei Anwendung von GC-MS-Verfahren muss die Bestimmung eine valide Schätzung der tatsächlichen Konzentration in einer Probe ermöglichen. Hohe Genauigkeit ist notwendig, damit die Zurückweisung eines Ergebnisses einer Probenuntersuchung aufgrund der geringen Zuverlässigkeit des bestimmten TEQ-Gehalts vermieden wird. Die Genauigkeit des Analyseverfahrens wird angegeben durch dieRichtigkeit (Differenz zwischen dem gemessenen Mittelwert eines Analyten in einem zertifizierten Material und seinem zertifizierten Wert, ausgedrückt als Prozentsatz dieses Wertes) und diePräzision (RSDR; relative Standardabweichung, berechnet aus unter Wiederholbarkeitsbedingungen ermittelten Ergebnissen).

5.3.2. Für bioanalytische Methoden ist die beobachtete Bioassay-Wiederfindung zu bestimmen. Die beobachtete Bioassay-Wiederfindung ist der BEQ-Gehalt, berechnet anhand einer TCDD-Kalibrierkurve oder einer PCB-126-Kalibrierkurve nach Korrektur um den Blindwert, geteilt durch den mittels Bestätigungsverfahren bestimmten TEQ-Wert. Dadurch sollen Faktoren wie der Verlust von PCDD/F und dioxinähnlichen Verbindungen während der einzelnen Extraktions- bzw. Reinigungsschritte, die Verstärkung oder Abschwächung des Signals durch mitextrahierte Verbindungen (agonistische bzw. antagonistische Wirkung), die Qualität der Kurvenanpassung oder Unterschiede zwischen TEF- und REP-(Relative-Potency-)Werten korrigiert werden. Die beobachtete Bioassay-Wiederfindung wird anhand geeigneter Referenzproben berechnet, die im Bereich der interessierenden Konzentration liegen und repräsentative Kongeneren-Muster aufweisen.

5.4.Validierung im Bereich des Höchstgehalts und allgemeine Qualitätssicherungsmaßnahmen

5.4.1. Die Laboratorien haben im Rahmen der Validierung und während der Routineanalytik den Nachweis der Leistungsfähigkeit eines Verfahrens im Bereich des Höchstgehalts, z.B. 0,5 x, 1 x und 2 x Höchstgehalt mit einem akzeptablen Variationskoeffizienten für wiederholte Untersuchung, zu führen.

5.4.2. Als interne Qualitätssicherungsmaßnahmen müssen regelmäßige Methodenleerwert-Kontrollen und Experimente mit dotierten Proben oder Analysen von Kontrollproben (sofern erhältlich, vorzugsweise zertifiziertes Referenzmaterial) durchgeführt werden. Für Methodenleerwert-Kontrollen, Experimente mit dotierten Proben und Analysen von Kontrollproben sind Qualitätskontroll-Charts anzufertigen und zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass die Analyseleistungsfähigkeit den Anforderungen genügt.

5.5.Bestimmungsgrenze

5.5.1. Bei einem bioanalytischen Screening-Verfahren ist eine Ermittlung der Bestimmungsgrenze (LOQ) nicht unbedingt erforderlich; es muss jedoch nachgewiesen sein, dass mit dem Verfahren eine Unterscheidung zwischen dem Methodenleerwert und dem Cut-off-Wert möglich ist. Wird ein BEQ-Gehalt angegeben, ist eine Konzentration festzulegen, ab der Ergebnisse mitgeteilt werden (Meldewert), um Proben, die ein Ergebnis unterhalb davon aufweisen, entsprechend einstufen zu können. Der Meldewert muss sich mindestens um den Faktor 3 von Methodenleerwert-Proben mit einem Signal unterhalb des Arbeitsbereichs unterscheiden. Er ist daher auf der Grundlage von Proben zu berechnen, die ungefähr den erforderlichen Mindestgehalt an Zielverbindungen enthalten, und nicht aus dem Signal/Rausch-Verhältnis oder einem Assay-Leerwert.

5.5.2. Die LOQ liegt beim Bestätigungsverfahren bei etwa einem Fuenftel des Höchstgehalts.

5.6.Analysekriterien

Damit die Ergebnisse der Bestätigungs- oder Screening-Verfahren zuverlässig sind, müssen folgende Kriterien im Bereich des Höchstgehalts für den TEQ-Wert bzw. den BEQ-Wert erfüllt sein, entweder bestimmt als Gesamt-TEQ bzw. Gesamt-BEQ (Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) oder separat für PCDD/F und dioxinähnliche PCB.

5.7.Besondere Anforderungen an Screening-Verfahren

5.7.1.Sowohl GC-MS-Verfahren als auch bioanalytische Methoden dürfen zum Screening verwendet werden. Bei GC-MS-Verfahren sind die unter Nummer 6 festgelegten Anforderungen zu erfüllen. Für zellbasierte bioanalytische Methoden sind unter Nummer 7 spezifische Anforderungen festgelegt.

5.7.2. Laboratorien, die zur Routinekontrolle von Proben Screening-Verfahren verwenden, müssen eng mit Laboratorien zusammenarbeiten, die das Bestätigungsverfahren anwenden.

5.7.3. Der Nachweis der Leistungsfähigkeit des Screening-Verfahrens ist während der Routineanalyse durch Qualitätssicherung und permanente Methodenvalidierung zu erbringen. Es muss ein kontinuierliches Programm zur Kontrolle der als konform beurteilten Analysenergebnisse geben.

5.7.4. Prüfung auf eine mögliche Unterdrückung der Zellantwort und auf Zytotoxizität:

20 % der Probenextrakte sind während des Routine-Screenings sowohl ohne als auch mit Zusatz einer dem Höchstgehalt oder dem Aktionsgrenzwert entsprechenden Menge von 2,3,7,8-TCDD zu analysieren, damit überprüft werden kann, ob das Signal möglicherweise durch interferierende Stoffe im Probenextrakt unterdrückt wird. Die gemessene Konzentration der dotierten Probe ist mit der Summe aus der Konzentration der nicht dotierten Probe und der Konzentration der Dotierung zu vergleichen. Liegt die gemessene Konzentration mehr als 25 % unter der berechneten (Summen-)Konzentration, ist dies ein Hinweis auf eine mögliche Signalunterdrückung und die entsprechende Probe ist einem GC-HRMS-Bestätigungsverfahren zu unterziehen. Die Ergebnisse sind anhand von Qualitätskontroll-Charts zu überwachen.

5.7.5. Qualitätssicherung bei als konform beurteilten Proben

Etwa 2-10 % der konformen Proben sind, je nach Probenmatrix und Laborerfahrung, mittels GC-HRMS zu bestätigen.

5.7.6. Bestimmung der Falsch-negativ-Raten auf Grundlage der Qualitätssicherungsdaten:

Die Rate falsch-negativer Ergebnisse beim Screening von Proben unter- und oberhalb der Höchstgehalte oder Aktionsgrenzwerte ist zu bestimmen. Der tatsächliche Anteil der falsch-negativen Ergebnisse muss unter 5 % liegen. Wenn im Rahmen der Qualitätssicherung je Matrix/Matrixgruppe mindestens 20 Proben bestätigt wurden, ist aus dieser Datenbasis die Falsch-negativ-Rate zu ermitteln. Die zur Ermittlung der Falsch-negativ-Rate mindestens erforderlichen 20 Ergebnisse können auch die Ergebnisse von in Ringversuchen oder im Rahmen eines Kontaminationsereignisses untersuchten Proben mit einschließen, die einen Konzentrationsbereich von beispielsweise bis zum doppelten Höchstgehalt abdecken. Die Proben müssen die häufigsten Kongeneren-Muster abdecken, die verschiedene Kontaminationsquellen repräsentieren.

Obwohl Screening-Verfahren hauptsächlich auf die Ermittlung derjenigen Proben abzielen, in denen der Aktionsgrenzwert überschritten wird, ist das ausschlaggebende Kriterium zur Bestimmung der Falsch-negativ-Rate der Höchstgehalt, unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit des Bestätigungsverfahrens.

5.7.7. Alle Proben, die im Screening-Verfahren als möglicherweise nicht konform beurteilt werden, müssen durch eine erneute vollständige Untersuchung der ursprünglichen Probe im Rahmen eines Bestätigungsverfahrens überprüft werden. Diese Proben dürfen auch zur Bewertung der Rate der falsch-positiven Ergebnisse herangezogen werden. Im Rahmen von Screening-Verfahren entspricht die Falsch-Positiv-Rate dem Anteil derjenigen Ergebnisse, von denen sich im Bestätigungsverfahren herausstellt, dass sie konform sind, nachdem sie zunächst als möglicherweise nicht konform eingestuft worden waren. Die Vorteile des Screening-Verfahrens sind auf Grundlage eines Vergleichs zwischen der Zahl der falsch-positiven Proben und der Gesamtzahl der untersuchten Proben zu bewerten. Dabei muss der Anteil der falsch-positiven Proben so gering sein, dass ein Screening vorteilhaft ist.

5.7.8. Unter Validierungsbedingungen müssen bioanalytische Methoden einen stichhaltigen Hinweis auf den TEQ-Gehalt ergeben, berechnet und ausgedrückt als BEQ.

Bei unter wiederholten Bedingungen angewandten bioanalytischen Methoden wäre in der Regel die laborinterne Wiederholbarkeit RSD_r geringer als die unter Reproduzierbarkeitsbedingungen (RSD_R).

6. Besondere Anforderungen an GC-MS-Verfahren für Screening- oder Bestätigungszwecke

6.1.Annehmbare Differenzen zwischen Obergrenze ("upper-bound") und Untergrenze ("lower-bound") (WHO-TEQ-Ergebnisse)

Zur Bestätigung der Überschreitung von Höchstgehalten oder erforderlichenfalls von Aktionsgrenzwerten darf die Differenz zwischen Ober- und Untergrenze nicht mehr als 20 % betragen.

6.2. Kontrolle der Wiederfindungsrate

6.2.1. Die Zugabe von¹³C-markierten 2,3,7,8-chlorsubstituierten internen PCDD/F-Standards und¹³C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards ist ganz zu Anfang des Analyseverfahrens, z.B. vor der Extraktion, durchzuführen, damit das Analyseverfahren validiert werden kann. Bei jeder der tetra- bis octachlorierten homologen Gruppen von PCDD/F und bei jeder der homologen Gruppen von dioxinähnlichen PCB muss mindestens ein Kongener zugegeben werden (alternativ dazu mindestens ein Kongener je massenspektrometrisch ausgewählter Ionenaufzeichnungsfunktion zur Überwachung von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB). Im Fall der Bestätigungsverfahren sind alle 17¹³C-markierten 2,3,7,8-substituierten internen PCDD/F-Standards und alle 12¹³C-markierten internen dioxinähnlichen PCB-Standards zu verwenden.

6.2.2. Die relativen Responsefaktoren sind mittels geeigneter Kalibrierlösungen auch für diejenigen Kongenere zu bestimmen, bei denen kein¹³C-markiertes Analogon zugegeben ist.

6.2.3. Bei Futtermitteln pflanzlichen Ursprungs und Futtermitteln tierischen Ursprungs, die weniger als 10 % Fett enthalten, ist die Zugabe der internen Standards vor der Extraktion obligatorisch. Bei Futtermitteln tierischen Ursprungs, die mehr als 10 % Fett enthalten, können die internen Standards entweder vor oder nach der Fettextraktion zugegeben werden. Die Extraktionseffizienz ist auf geeignete Weise zu validieren, abhängig davon, auf welcher Stufe die internen Standards zugegeben werden.

6.2.4. Vor der GC-MS-Analyse sind 1 oder 2 Wiederfindungs-(Surrogat-)Standard(s) zuzugeben.

6.2.5. Es ist eine Kontrolle der Wiederfindungsrate erforderlich. Bei Bestätigungsverfahren müssen die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards zwischen 60 und 120 % liegen. Geringere oder höhere Wiederfindungsraten für einzelne Kongenere, insbesondere für einige hepta- und octachlorierte Dibenzo-pdioxine und Dibenzofurane, werden unter der Bedingung akzeptiert, dass ihr Beitrag zum TEQ-Wert 10 % des gesamten TEQ-Werts (basierend auf der Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) nicht übersteigt. Bei GC-MS-Screening-Verfahren müssen die Wiederfindungen zwischen 30 und 140 % liegen.

6.3. Entfernung interferierender Stoffe

• Die PCDD/F sind von interferierenden chlorierten Verbindungen, wie z.B. nicht dioxinähnlichen PCB und chlorierten Diphenylethern, mittels geeigneter chromatografischer Verfahren abzutrennen (vorzugsweise mit Florisil-, Aluminiumoxid- und/oder Aktivkohlensäule).
• Die gaschromatografische Auftrennung der Isomere ist < 25 % von Peak zu Peak zwischen 1,2,3,4,7,8-HxCDF und 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

6.4.Kalibrierung mittels Standardkurve

Die Kalibrierkurve muss alle jeweils relevanten Bereiche der Höchstgehalte oder Aktionsgrenzwerte abdecken.

6.5.Besondere Kriterien für Bestätigungsverfahren

• Für GC-HRMS:
• Bei der HRMS muss die Auflösung für den gesamten Massenbereich bei 10 % Tal in der Regel gleich oder größer als 10.000 sein.
• Erfüllung weiterer Identifizierungs- und Bestätigungskriterien, wie sie in international anerkannten Normen, z.B. in der Norm EN 16215:2012 (Futtermittel - Bestimmung von Dioxinen und dioxinähnlichen PCB mittels GC-HRMS und von Indikator-PCB mittels GC-HRMS) und/oder in den überarbeiteten EPA-Methoden 1613 und 1668, beschrieben sind.
• Für GC-MS/MS:
• Messung von mindestens 2 spezifischen Vorläufer-Ionen, jeweils mit einem spezifischen dazugehörigen Übergangs-Produkt-Ion für alle markierten und nicht markierten Analyten im Untersuchungsbereich.
• Zulässige Höchsttoleranz für relative Ionenintensitäten von ± 15 % für ausgewählte Übergangs-Produkt-Ionen im Vergleich zu berechneten oder gemessenen Werten (Mittelwert aus Kalibrierstandards) unter Anwendung identischer MS/MS-Bedingungen, insbesondere Kollisionsenergie und Kollisionsgasdruck, für jeden Übergang eines Analyts.
• Festlegung der Auflösung für jeden Quadrupol gleichwertig oder besser als die Einheitsmassenauflösung (Einheitsmassenauflösung: ausreichende Auflösung zur Auftrennung zweier Peaks, die sich um eine Masseneinheit unterscheiden), um mögliche Auswirkungen von Interferenzen auf die interessierenden Analyten zu minimieren.
• Erfüllung der weiteren Kriterien, wie sie in international anerkannten Normen, z.B. in der Norm EN 16215:2012 (Futtermittel - Bestimmung von Dioxinen und dioxinähnlichen PCB mittels GC-HRMS und von Indikator-PCB mittels GC-HRMS) und/oder in den überarbeiteten EPA-Methoden 1613 und 1668, beschrieben sind, die Pflicht zur Verwendung von GC-HRMS ausgenommen.

7. Besondere Anforderungen an bioanalytische Methoden

Bioanalytische Methoden sind Verfahren, die auf der Anwendung biologischer Grundsätze beruhen, beispielsweise zellbasierte Assays, Rezeptor-Assays oder Immunoassays. In Nummer 7 werden allgemeine Anforderungen an bioanalytische Methoden festgelegt.

Mit einem Screening-Verfahren wird eine Probe prinzipiell entweder als konform oder als vermutlich nicht konform eingestuft. Dazu wird der berechnete BEQ-Wert mit dem Cut-off-Wert verglichen (siehe Nummer 7.3). Proben, die unter dem Cut-off-Wert liegen, gelten als konform, Proben, die dem Cut-off-Wert entsprechen oder diesen überschreiten, gelten als vermutlich nicht konform und müssen mit einem Bestätigungsverfahren untersucht werden. In der Praxis kann ein BEQ-Gehalt, der zwei Drittel des Höchstgehalts entspricht, als Cut-off-Wert dienen, sofern eine Falsch-negativ-Rate von unter 5 % sowie eine annehmbare Rate von falsch-positiven Ergebnissen gewährleistet wird. Da für PCDD/F und für die Summe von PCDD/F und dioxinähnliche PCB unterschiedliche Höchstgehalte gelten, ist zur Prüfung der Konformität der Proben ohne Fraktionierung ein geeigneter Bioassay-Cut-off-Wert für PCDD/F erforderlich. Zur Überprüfung von Proben, in denen die Aktionsgrenzwerte überschritten werden, eignet sich ein entsprechender Prozentsatz des jeweiligen Aktionsgrenzwerts als Cut-off-Wert.

Wird ein ungefährer Gehalt in BEQ ausgedrückt, müssen die Probenergebnisse angegeben werden, die im Arbeitsbereich liegen und den Meldewert überschreiten (siehe Nummern 7.1.1. und 7.1.6.).

7.1. Signalauswertung

7.1.1. Allgemeine Anforderungen

• Berechnet man die Konzentrationen anhand einer TCDD-Kalibrierkurve, so weisen die Werte am oberen Ende der Kurve eine große Variabilität (hoher Variationskoeffizient - VK) auf. Der Arbeitsbereich ist der Bereich, in dem der VK weniger als 15 % beträgt. Das untere Ende des Arbeitsbereichs (Meldegrenze) muss mindestens um den Faktor drei über den Methodenleerwerten liegen. Der EC₇₀-Wert (70 % der maximalen effektiven Konzentration) stellt normalerweise das obere Ende des Arbeitsbereichs dar; es liegt aber niedriger, wenn der VK in diesem Bereich über 15 % liegt. Der Arbeitsbereich wird im Rahmen der Validierung festgelegt. Die Cut-off-Werte (siehe Nummer 7.3) müssen vollständig innerhalb des Arbeitsbereichs liegen.
• Standardlösungen und Probenextrakte sind dreifach oder mindestens zweifach zu messen. Werden Zweifachmessungen durchgeführt, müssen eine Standardlösung oder ein Kontrollextrakt in vier bis sechs über die Platte verteilten Vertiefungen getestet werden und ein Signal oder eine Konzentration (nur im Arbeitsbereich möglich) auf Grundlage eines VK < 15 % hervorbringen.

7.1.2. Kalibrierung

7.1.2.1. Kalibrierung mittels Standardkurve

• Die Gehalte in Proben werden durch Vergleich der im Assay gemessenen Zellantwort mit einer TCDD-Kalibrierkurve (oder einer PCB-126-Kalibrierkurve oder einer Kalibrierkurve aus einer Standardmischung aus PCDD/F und dioxinähnlichen PCB) geschätzt, um den BEQ-Gehalt im Extrakt und somit in der Probe zu berechnen.
• Eine Kalibrierkurve muss aus 8 bis 12 Konzentrationen bestehen (jeweils mindestens zweifach) und über eine ausreichende Zahl von Konzentrationen am unteren Ende der Kurve (Arbeitsbereich) verfügen. Besondere Aufmerksamkeit ist der Qualität der Kurvenanpassung im Arbeitsbereich zu widmen. Der R2-Wert als solcher hilft wenig oder gar nicht bei der Einschätzung der Qualität der Anpassung bei nicht linearer Regression. Eine bessere Anpassung erhält man durch die Minimierung des Unterschieds zwischen dem berechneten und dem beobachteten Gehalt im Arbeitsbereich der Kurve, z.B. durch Minimierung der Summe der Abweichungsquadrate.
• Der geschätzte BEQ-Gehalt in der Probe muss anschließend um den für eine Matrix-/Reagenzienleerwert-Probe (zur Berücksichtigung von Verunreinigungen durch die verwendeten Lösungsmittel und Chemikalien) errechneten BEQ-Wert und um die beobachtete Wiederfindung (errechnet aus dem BEQ-Gehalt geeigneter Referenzproben mit repräsentativen Kongeneren-Mustern im Bereich des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwertes) korrigiert werden. Bei der Wiederfindungskorrektur muss die beobachtete Wiederfindung sich im geforderten Bereich befinden (siehe Nummer 7.1.4). Die für die Wiederfindungskorrektur verwendeten Referenzproben müssen den unter Nummer 7.2 aufgeführten Anforderungen entsprechen.

7.1.2.2. Kalibrierung anhand von Referenzproben

Alternativ kann eine Kalibrierkurve auf Grundlage von mindestens vier Referenzproben verwendet werden (siehe Nummer 7.2.4): eine Matrixleerwert-Probe sowie drei Referenzproben, die jeweils 0,5 x, 1 x und 2 x den Höchstgehalt oder den Aktionsgrenzwert enthalten, wodurch keine Notwendigkeit zur Korrektur um Blindwerte und Wiederfindung besteht, wenn sich die Matrixeigenschaften bei Referenzproben und unbekannten Proben decken. In diesem Fall kann das Signal, das 2/3 des Höchstgehalts entspricht (siehe Nummer 7.3), direkt auf Grundlage dieser Proben berechnet und als Cut-off-Wert verwendet werden. Zur Überprüfung von Proben, in denen die Aktionsgrenzwerte überschritten werden, eignet sich ein entsprechender Prozentsatz dieser Aktionsgrenzwerte als Cut-off-Wert.

7.1.3. Separate Bestimmung von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB

Extrakte können in Fraktionen, welche PCDD/F und dioxinähnliche PCB enthalten, aufgetrennt werden, sodass PCDD/F-TEQ und TEQ der dioxinähnlichen PCB-Verbindungen (jeweils als BEQ) getrennt angegeben werden können. Zur Bewertung der Ergebnisse für die Fraktion, die dioxinähnliche PCB enthält, ist vorzugsweise eine PCB-126-Standardkalibrierkurve zu verwenden.

7.1.4. Beobachtete Bioassay-Wiederfindung

Die "beobachtete Bioassay-Wiederfindung" ist auf Grundlage geeigneter Referenzproben mit repräsentativen Kongeneren-Mustern im Bereich des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwert zu berechnen und wird als Prozentsatz des BEQ-Gehalts im Vergleich zum TEQ-Gehalt ausgedrückt. Je nachdem, welche Art von Assay oder TEF ¹² verwendet wird, können die Unterschiede zwischen TEF- und REP-Faktoren in dioxinähnlichen PCB zu niedrigeren Wiederfindungswerten für dioxinähnliche PCB im Vergleich zu PCDD/F führen. Daher muss die beobachtete Bioassay-Wiederfindung bei einer getrennten Bestimmung von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB für dioxinähnliche PCB 20 bis 60 % und für PCDD/F 50 bis 130 % betragen (bei Verwendung einer TCDD-Kalibrierkurve). Der Beitrag der dioxinähnlichen PCB zur Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB kann je nach Matrices und Proben unterschiedlich sein; dies spiegelt sich in den Bereichen der beobachteten Bioassay-Wiederfindung für die Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB wider, die zwischen 30 und 130 % liegen müssen. Jede wesentliche Änderung der TEF-Werte für PCDD/F und dioxinähnliche PCB in den EU-Rechtsvorschriften erfordert eine Überarbeitung dieser Bereiche.

7.1.5. Kontrolle der Wiederfindung nach Reinigung der Probenextrakte

Der Verlust von Verbindungen während der Reinigung ist im Rahmen der Validierung zu überprüfen. Eine Matrixleerprobe, dotiert mit einem Gemisch verschiedener Kongenere, ist dem Reinigungsverfahren zu unterziehen (mindestens n = 3), und Wiederfindung und Streuung sind mittels eines Bestätigungsverfahrens zu untersuchen. Die Wiederfindung muss zwischen 60 und 120 % betragen, insbesondere für Kongenere, die in verschiedenen Gemischen jeweils mehr als 10 % des TEQ-Gehalts ausmachen.

7.1.6. Meldegrenze

Werden BEQ-Gehalte angegeben, ist auf der Grundlage relevanter Matrix-Proben, die typische Kongeneren-Muster aufweisen, eine Meldegrenze zu ermitteln; dabei ist die Kalibrierkurve der Standards aufgrund ihrer geringen Präzision im unteren Bereich nicht heranzuziehen. Die Einflüsse aus Extraktion und Reinigung müssen berücksichtigt werden. Die Meldegrenze muss mindestens um den Faktor drei über den Methodenleerwerten liegen.

7.2. Verwendung von Referenzproben

7.2.1. Referenzproben müssen repräsentativ für Probenmatrix, Kongeneren-Muster und Konzentrationen für PCDD/F und dioxinähnliche PCB im Bereich des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts sein.

7.2.2. Bei jeder Test-Reihe ist eine Matrixleerprobe, oder, sofern dies nicht möglich ist, eine Methodenleerwert-Probe, sowie eine Referenzprobe im Bereich des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts einzubeziehen. Diese Proben müssen zur gleichen Zeit und unter identischen Bedingungen extrahiert und analysiert werden. Die Referenzprobe muss im Vergleich zu der Matrixleerprobe ein deutlich höheres Signal aufweisen, wodurch die Eignung des Analyseverfahrens gewährleistet ist. Solche Proben können zur Korrektur um Leerwert und Wiederfindung verwendet werden.

7.2.3. Referenzproben, die zur Korrektur um die Wiederfindung herangezogen werden, müssen repräsentativ für die untersuchten Proben sein, d. h., die Kongeneren-Muster dürfen nicht zu einer Unterschätzung der Gehalte führen.

7.2.4.Zusätzliche Referenzproben, deren Konzentration z.B. das 0,5- und 2-Fache des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts beträgt, können einbezogen werden, damit die ordnungsgemäße Durchführung der Untersuchungen in dem für die Kontrolle des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts relevanten Bereich nachgewiesen werden kann. In Kombination können diese Proben zur Berechnung der BEQ-Gehalte in den untersuchten Proben verwendet werden (siehe Nummer 7.1.2.2).

7.3.Bestimmung der Cut-off-Werte

Die Beziehung zwischen den in BEQ ausgedrückten Ergebnissen der bioanalytischen Methode und den in TEQ ausgedrückten Ergebnissen von Bestätigungsverfahren ist zu ermitteln, z.B. durch matrixbezogene Kalibrierexperimente unter Verwendung von Referenzproben, die mit 0, 0,5 x, 1 x und 2 x HG dotiert sind und auf jeder Konzentrationsstufe jeweils 6 Mal untersucht werden (n = 24). Korrekturfaktoren (Leerwert und Wiederfindung) können auf der Grundlage dieses Verhältnisses geschätzt werden, sind jedoch gemäß Nummer 7.2.2 zu überprüfen.

Für die Entscheidung, ob eine Probe den Höchstgehalten entspricht, oder gegebenenfalls zur Überprüfung der Aktionsgrenzwerte sind Cut-off-Werte zu ermitteln, wobei die jeweiligen Höchstgehalte bzw. Aktionsgrenzwerte entweder einzeln für PCDD/F und dioxinähnliche PCB oder aber für die Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB festgelegt sein können. Sie stellen den unteren Endpunkt der Verteilung bioanalytischer Ergebnisse (korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) von Proben dar, die Gehalte an der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens aufweisen, berechnet auf Grundlage eines Vertrauensniveaus von 95 %, was eine Falsch-negativ-Rate von < 5 % impliziert, und auf Basis einer RSD_R unter 25 %. Die Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens entspricht dem Höchstgehalt zuzüglich der erweiterten Messunsicherheit.

Der Cut-off-Wert (in BEQ) kann gemäß einem der unter den Nummern 7.3.1, 7.3.2 oder 7.3.3 beschriebenen Ansätze berechnet werden. (siehe Abbildung 1).

7.3.1. Verwendung des unteren Bands des Prognoseintervalls von 95 % an der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens:

Dabei ist

BEQDL	der BEQ-Wert, der der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens entspricht, die wiederum dem Höchstgehalt unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit entspricht.
sy,x	die Reststandardabweichung
t α,f = m-2	der Student-Faktor (α = 5 %, f = Freiheitsgrade, einseitig)
m	die Gesamtzahl der Kalibrierpunkte (Laufzahl j)
n	die Anzahl der Wiederholungen auf jeder Ebene
xi	die Probenkonzentration (in TEQ) des Kalibrierpunkts i, durch ein Bestätigungsverfahren ermittelt
	der Mittelwert der Konzentrationen (in TEQ) aller Kalibrierproben

7.3.2. Berechnung aus bioanalytischen Ergebnissen (korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) aus der Mehrfachuntersuchung (n ≥ 6) von Proben, die Gehalte an der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens aufweisen, als unterer Endpunkt der Datenverteilung am entsprechenden BEQ-Mittelwert:

Cut-off-Wert = BEQ_DL - 1,64 × SD_R

Dabei ist

7.3.3. Berechnung als Mittelwert der bioanalytischen Ergebnisse (in BEQ, korrigiert um Leerwert und Wiederfindung) auf der Grundlage mehrfacher Untersuchungen (n ≥ 6) von Proben, die mit zwei Dritteln des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts kontaminiert sind, auf Grundlage der Beobachtung, dass dieser Wert in der Nähe des gemäß Nummer 7.3.1 oder 7.3.2 bestimmten Cut-off-Wertes liegt.

Berechnung der Cut-off-Werte auf der Grundlage eines Vertrauensniveaus von 95 %, was eine Falsch-negativ-Rate von < 5 % impliziert, und auf Basis einer RSD_R < 25 %:

1. vom unteren Band des 95 %igen Prognoseintervalls an der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens,
2. aus Mehrfachuntersuchungen (n ≥ 6) von Proben mit Gehalten an der Entscheidungsgrenze des Bestätigungsverfahrens, als unterer Endpunkt der Datenverteilung (in der Abbildung durch eine glockenförmige Kurve dargestellt) am entsprechenden BEQ-Mittelwert.

Abbildung 1

7.3.4.Beschränkungen der Cut-off-Werte

Auf BEQ basierende Cut-off-Werte, die anhand der im Rahmen der Validierung und unter Verwendung einer begrenzten Anzahl von Proben mit unterschiedlichen Matrix-/Kongeneren-Mustern erzielten RSD_R berechnet wurden, können höher sein als die auf TEQ basierenden Höchstgehalte oder Aktionsgrenzwerte, da hier die Präzision höher ist, als es in einer Routine möglich ist, in der ein unbekanntes Spektrum möglicher Kongeneren-Muster überprüft werden muss. In solchen Fällen ist der Berechnung der Cut-off-Werte eine RSD_R = 25 % zugrunde zu legen, oder aber es sind zwei Drittel des Höchstgehalts oder des Aktionsgrenzwerts als Cut-off-Wert zu verwenden.

7.4. Leistungsmerkmale

7.4.1. Da bei bioanalytischen Methoden keine internen Standards verwendet werden können, sind Tests zur Wiederholbarkeit bioanalytischer Methoden durchzuführen, um Informationen über die Standardabweichung innerhalb einer Testreihe bzw. zwischen Testreihen zu erhalten. Die Wiederholbarkeit muss unter 20 % liegen, die laborinterne Reproduzierbarkeit unter 25 %. Grundlage dafür müssen die nach Korrektur um Blindwert und Wiederfindung als BEQ berechneten Konzentrationen sein.

7.4.2. Während der Validierung muss nachgewiesen werden, dass mit dem Testverfahren zwischen einer Leerprobe und einem Gehalt am Cut-off-Wert unterschieden werden kann, sodass Proben, deren Gehalt über dem entsprechenden Cut-off-Wert liegt, identifiziert werden können (siehe Nummer 7.1.2).

7.4.3. Die zu bestimmenden Verbindungen, mögliche auftretende Störungen und der maximal akzeptable Leerwert müssen festgelegt werden.

7.4.4. Die Standardabweichung in Prozent, mit der die Signalwerte oder die aus den Signalwerten berechneten Konzentrationen (nur möglich im Arbeitsbereich) behaftet sind, darf bei einer dreifachen Bestimmung eines Probenextrakts nicht mehr als 15 % betragen.

7.4.5. Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit einer bioanalytischen Methode über einen konstanten Zeitraum hinweg sind die unkorrigierten Ergebnisse der Referenzprobe(n), ausgedrückt in BEQ (Leerwert und Höchstgehalt oder Aktionsgrenzwert), heranzuziehen.

7.4.6. Für Leerwert-Proben und für jede Art von Referenzproben sind Qualitätskontroll-Charts anzufertigen und zu prüfen, damit sichergestellt ist, dass die analytische Leistungsfähigkeit den Anforderungen genügt, insbesondere bei Leerwert-Proben im Hinblick auf den erforderlichen Mindestabstand zum unteren Ende des Arbeitsbereichs und für Referenzproben hinsichtlich der laborinternen Reproduzierbarkeit. Leerwert-Proben sind so zu prüfen, dass Falsch-negative Ergebnisse bei Abzug der Werte vermieden werden.

7.4.7. Die Ergebnisse der in Bezug auf verdächtige Proben durchgeführten Bestätigungsverfahren und von 2 bis 10 % der konformen Proben (mindestens 20 Proben je Matrix) sind zu sammeln und zur Bewertung der Leistungsfähigkeit des Screening-Verfahrens und der Beziehung zwischen BEQ und TEQ zu verwenden. Diese Datenbank kann zur Neubewertung der Cut-off-Werte für Routineproben der validierten Matrices genutzt werden.

7.4.8. Die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens kann auch durch Teilnahme an Ringversuchen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse von in Ringversuchen analysierten Proben, die einen Konzentrationsbereich bis zum doppelten Höchstgehalt abdecken, können zur Bewertung der Falsch-negativ-Rate herangezogen werden, wenn ein Laboratorium seine Leistungsfähigkeit unter Beweis gestellt hat. Die Proben müssen die häufigsten Kongeneren-Muster abdecken, die verschiedene Kontaminationsquellen repräsentieren.

7.4.9. Bei Kontaminationsfällen können die Cut-off-Werte neu ermittelt werden, um den Besonderheiten von Matrix und Kongeneren-Muster des jeweiligen Zwischenfalls Rechnung zu tragen.

8. Bericht über die Ergebnisse

8.1.Bestätigungsverfahren

8.1.1. Die Untersuchungsergebnisse müssen die Werte der einzelnen Kongenere von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB enthalten, und die TEQ-Werte müssen als Untergrenze ("lower-bound"), Obergrenze ("upper-bound") und Mittelwert ("medium-bound") gemeldet werden, damit möglichst viele Informationen in den Untersuchungsberichten enthalten sind und die Ergebnisse somit entsprechend den speziellen Anforderungen interpretiert werden können.

8.1.2. In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB verwendete Verfahren genannt werden.

8.1.3. Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfügung zu stellen, falls die Wiederfindungen außerhalb des unter Nummer 6.2.5 genannten Bereichs liegen, falls die Gehalte in den Proben den Höchstgehalt überschreiten (in diesem Fall die Wiederfindungen aus einer der beiden Untersuchungen) sowie in anderen Fällen auf Nachfrage.

8.1.4. Da bei der Entscheidung über die Konformität einer Probe die erweiterte Messunsicherheit zu berücksichtigen ist, ist dieser Parameter vorzulegen. Das Analyseergebnis ist als x ± U anzugeben, wobei x das Analyseergebnis darstellt und U die erweiterte Messunsicherheit unter Verwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, was einem Vertrauensniveau von ca. 95 % entspricht. Bei einer getrennten Bestimmung des Gehalts an PCDD/F und dioxinähnlichen PCB ist die Summe der geschätzten erweiterten Messunsicherheit der getrennten Analyseergebnisse der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB für die Berechnung der Summe der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB zu verwenden.

8.1.5. Die Ergebnisse sind in denselben Einheiten und mit mindestens derselben Anzahl signifikanter Stellen anzugeben wie die in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalte.

8.2.Bioanalytische Screening-Verfahren

8.2.1. Das Ergebnis des Screenings ist anzugeben als "konform" oder "vermutlich nicht konform" ("verdächtig").

8.2.2. Außerdem können annähernde Ergebniswerte für PCDD/F und/oder dioxinähnliche PCB in BEQ, nicht in TEQ, angegeben werden.

8.2.3. Proben, deren Gehalt unterhalb der Meldegrenze liegt, sind als solche zu bezeichnen. Proben, deren Gehalt "oberhalb des Arbeitsbereichs" liegt, sind mit dieser Angabe zu melden, und der der Obergrenze des Arbeitsbereichs entsprechende Gehalt ist in BEQ anzugeben.

8.2.4. In dem Bericht muss für jede Art von Probenmatrix der Höchstgehalt oder der Aktionsgrenzwert genannt werden, auf dem die Bewertung beruht.

8.2.5. Aus dem Bericht müssen die Art des verwendeten Tests, die grundlegenden Testprinzipien und die Art der Kalibrierung hervorgehen.

8.2.6. In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB verwendete Verfahren genannt werden.

8.2.7. Für Proben, die vermutlich nicht konform sind, muss der Bericht einen Hinweis auf die zu ergreifenden Maßnahmen enthalten. Die Konzentration von PCDD/F und der Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in diesen Proben mit erhöhten Gehalten muss durch ein Bestätigungsverfahren ermittelt/bestätigt werden.

8.2.8. Nicht konforme Ergebnisse werden nur gemeldet, wenn sie in einem Bestätigungsverfahren ermittelt wurden.

8.3. Physikalisch-chemische Screening-Verfahren

8.3.1. Das Ergebnis des Screenings ist anzugeben als "konform" oder "vermutlich nicht konform" ("verdächtig").

8.3.2. In dem Bericht muss für jede Art von Probenmatrix der Höchstgehalt oder der Aktionsgrenzwert genannt werden, auf dem die Bewertung beruht.

8.3.3. Zudem können Werte der einzelnen Kongenere von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB sowie als Untergrenze, Obergrenze und Mittelwert gemeldete TEQ-Werte angegeben werden. Die Ergebnisse sind in denselben Einheiten und mit mindestens derselben Anzahl signifikanter Stellen anzugeben wie die in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalte.

8.3.4. Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfügung zu stellen, falls die Wiederfindungen außerhalb des unter Nummer 6.2.5 genannten Bereichs liegen, falls die Gehalte in den Proben den Höchstgehalt überschreiten (in diesem Fall die Wiederfindungen aus einer der beiden Untersuchungen) sowie in anderen Fällen auf Nachfrage.

8.3.5. Aus dem Bericht muss hervorgehen, welches GC-MS-Verfahren verwendet wurde.

8.3.6. In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCDD/F und dioxinähnlichen PCB verwendete Verfahren genannt werden.

8.3.7. Für Proben, die vermutlich nicht konform sind, muss der Bericht einen Hinweis auf die zu ergreifenden Maßnahmen enthalten. Die Konzentration von PCDD/F und der Summe von PCDD/F und dioxinähnlichen PCB in diesen Proben mit erhöhten Gehalten muss durch ein Bestätigungsverfahren ermittelt/bestätigt werden.

8.3.8. Ob ein Wert nicht konform ist, kann nur in einem Bestätigungsverfahren entschieden werden.

Kapitel III
Probenvorbereitung und Anforderungen an Untersuchungsverfahren zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an nicht dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln

1. Anwendungsbereich

Die in diesem Kapitel beschriebenen Anforderungen gelten, wenn Futtermittel zur amtlichen Kontrolle des Gehalts an nicht dioxinähnlichen PCB sowie für die Probenvorbereitung und Untersuchungsanforderungen zu anderen regulatorischen Zwecken, darunter die Kontrollen der Futtermittelunternehmer zur Gewährleistung der Vorschriftsmäßigkeit gemäß der Verordnung (EG) Nr. 183/2005, untersucht werden.

2. Anzuwendende Nachweisverfahren

Gaschromatografie/Elektroneneinfangdetektor (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS oder gleichwertige Verfahren.

3. Bestimmung und Bestätigung der interessierenden Analyten

3.1. Relative Retentionszeit im Verhältnis zu internen Standards oder Referenzstandards (akzeptable Abweichung ± 0,25 %).

3.2. Gaschromatografische Trennung der nicht dioxinähnlichen PCB von interferierenden Stoffen, insbesondere von koeluierenden PCB und insbesondere dann, wenn die Gehalte der Proben an der gesetzlichen Grenze liegen und bestätigt werden muss, dass sie nicht konform sind ¹³.

3.3.Anforderungen an GC-MS-Techniken

Messung von mindestens der folgenden Anzahl an Molekül-Ionen oder charakteristischen Ionen des Molekül-Clusters:

1. zwei spezifische Ionen bei HRMS;
2. drei spezifische Ionen bei LRMS,
3. zwei spezifische Vorläufer-Ionen, jeweils mit einem spezifischen dazugehörigen Übergangsprodukt-Ion bei MS-MS.

Zulässige Höchsttoleranzen für das Isotopenhäufigkeitsverhältnis für ausgewählte Massenfragmente:

Relative Abweichung des Isotopenhäufigkeitsverhältnisses ausgewählter Massenfragmente von der theoretischen Häufigkeit oder dem Kalibrierstandard für das Zielion (das am häufigsten vorkommende Ion) und das/die Qualifizier-Ion/-en: ± 15 %

3.4.Anforderungen an GC-ECD-Techniken

Ergebnisse, die den Höchstgehalt überschreiten, sind anhand von zwei GC-Säulen mit stationären Phasen unterschiedlicher Polarität zu bestätigen.

4. Nachweis der Leistungsfähigkeit des Verfahrens

Die Leistungsfähigkeit der Methode im Bereich des Höchstgehalts (0,5- bis 2facher Höchstgehalt) mit einem akzeptablen Variationskoeffizienten für wiederholte Analysen (siehe Anforderungen an die Laborpräzision unter Nummer 9) ist zu validieren.

5. Bestimmungsgrenze

Die Summe der Bestimmungsgrenzen (LOQ) ¹⁴ nicht dioxinähnlicher PCB darf ein Drittel des Höchstgehalts nicht übersteigen ¹⁵.

6. Qualitätssicherung

Regelmäßige Blindkontrollen, Analysen dotierter Proben, Qualitätssicherungsproben, Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen zu relevanten Matrices.

7. Kontrolle der Wiederfindungsrate

7.1. Es sind geeignete interne Standards mit physikalisch-chemikalischen Eigenschaften, die denen der interessierenden Analyten vergleichbar sind, zu verwenden.

7.2.Zugabe interner Standards:

Zugabe zu Erzeugnissen (vor Extraktion und Clean-up).

7.3. Anforderungen an Verfahren, in denen alle sechs isotopenmarkierten Indikator-PCB-Kongenere verwendet werden:

1. Die Ergebnisse sind um die Wiederfindung interner Standards zu korrigieren;
2. Die Wiederfindung isotopenmarkierter interner Standards muss zwischen 60 und 120 % betragen;
3. geringere oder höhere Wiederfindungsraten für einzelne Kongenere, die weniger als 10 % der Summe der nicht dioxinähnlichen PCB ausmachen, sind akzeptabel.

7.4. Anforderungen an Verfahren, in denen nicht alle sechs isotopenmarkierten internen Standards oder andere interne Standards verwendet werden:

1. die Wiederfindung des/der internen Standards ist in jeder Probe zu überprüfen;
2. die Wiederfindungen des/der internen Standard(s) müssen zwischen 60 und 120 % betragen;
3. die Ergebnisse sind um die Wiederfindungen interner Standards zu korrigieren.

7.5. Die Wiederfindungen nicht markierter Kongenere sind mittels dotierter Proben oder Qualitätskontrollproben mit Konzentrationen im Bereich des Höchstgehalts zu prüfen. Für diese Kongenere sind Wiederfindungsraten zwischen 60 und 120 % akzeptabel.

8. Anforderungen an Laboratorien

Gemäß den Bestimmungen der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 müssen die Laboratorien von einer anerkannten Stelle akkreditiert sein, die nach ISO Guide 58 arbeitet, damit sichergestellt ist, dass die Laboratorien bei der Untersuchung Qualitätssicherungsverfahren anwenden. Die Laboratorien müssen gemäß der Norm EN ISO/IEC 17025 akkreditiert sein. Zudem ist den in den technischen Leitlinien für die Schätzung der Messunsicherheit und der Bestimmungsgrenzen für die Untersuchung auf PCB beschriebenen Grundsätzen - falls zutreffend - zu folgen ¹⁶.

9. Leistungsmerkmale: Kriterien für die Summe der nicht dioxinähnlichen PCB im Bereich des Höchstgehalts:

10. Bericht über die Ergebnisse

10.1. Die Untersuchungsergebnisse müssen die Werte der einzelnen nicht dioxinähnlichen PCB und der Summe solcher PCB-Kongenere enthalten, angegeben als Untergrenze ("lower-bound"), Obergrenze ("upper-bound") und Mittelwert ("medium-bound"), damit möglichst viele Informationen in den Untersuchungsberichten enthalten sind und die Ergebnisse somit entsprechend den speziellen Anforderungen interpretiert werden können.

10.2. In dem Bericht muss das zur Extraktion der PCB verwendete Verfahren genannt werden.

10.3. Die Wiederfindungsraten der einzelnen internen Standards sind zur Verfügung zu stellen, falls die Wiederfindungen außerhalb des unter Nummer 7 genannten Bereichs liegen, falls die Gehalte in den Proben den Höchstgehalt überschreiten sowie in anderen Fällen auf Nachfrage.

10.4. Da bei der Entscheidung über die Konformität einer Probe die erweiterte Messunsicherheit zu berücksichtigen ist, ist dieser Parameter ebenfalls vorzulegen. Das Analyseergebnis ist als x ± U anzugeben, wobei x das Analyseergebnis darstellt und U die erweiterte Messunsicherheit unter Verwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, was einem Vertrauensniveau von ca. 95 % entspricht.

10.5. Die Ergebnisse sind in denselben Einheiten und mit mindestens derselben Anzahl signifikanter Stellen anzugeben wie die in der Richtlinie 2002/32/EG festgelegten Höchstgehalte."

.

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Bestimmung von Bestandteilen tierischen Ursprungs in Futtermitteln wird nach den Bestimmungen dieses Anhangs mit Hilfe der Lichtmikroskopie oder der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erbracht.

Mit diesen beiden Methoden können Bestandteile tierischen Ursprungs in Einzelfuttermitteln und Mischfuttermitteln nachgewiesen werden. Die Berechnung der Menge solcher Bestandteile in Einzelfuttermitteln und Mischfuttermitteln ist mit ihnen jedoch nicht möglich. Bei beiden Methoden liegt die Nachweisgrenze unter 0,1 % (m/m).

Mit der PCR-Methode lässt sich die taxonomische Gruppe der in Einzelfuttermitteln und Mischfuttermitteln vorhandenen Bestandteile tierischen Ursprungs ermitteln.

Die Methoden werden eingesetzt, um die Anwendung der Verbote gemäß Artikel 7 Absatz 1 und Anhang IV der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 sowie Artikel Absatz 1 der Verordnung (EG) Nr. 1069/2009 zu überwachen.

Abhängig von der Art des zu untersuchenden Futtermittels können diese Methoden für eine Untersuchung entweder einzeln oder kombiniert nach der Standardarbeitsanweisung (SOP) angewandt werden, die das EU-Referenzlabor für tierische Proteine in Futtermitteln (EURL-AP) aufgestellt und auf seiner Website ¹ veröffentlicht hat.

2. Methoden

2.1. Lichtmikroskopie

2.1.1. Grundsatz

Die tierischen Bestandteile, die in Einzelfuttermitteln und Mischfuttermitteln durch Analyse nachzuweisen sind, werden anhand charakteristischer und mikroskopisch erkennbarer Merkmale wie Muskelfasern und andere Fleischpartikel, Knorpel, Knochen, Horn, Haare, Borsten, Blut, Federn, Eierschalen, Gräten und Schuppen identifiziert.

2.1.2. Reagenzien und Geräte

2.1.2.1. Reagenzien

2.1.2.1.1. Konzentrationsmittel

2.1.2.1.1.1. Tetrachlorethylen (Dichte 1,62)

2.1.2.1.2. Nachweisreagenz

2.1.2.1.2.1. Alizarinrot-Lösung (2,5 ml 1 M Salzsäure in 100 ml Wasser lösen und dieser Lösung 200 mg Alizarinrot zufügen),

2.1.2.1.3. Einbettungsmedien

2.1.2.1.3.1. Lauge (NaOH, Massenkonzentration = 2,5 %, oder KOH, Massenkonzentration = 2,5 %)

2.1.2.1.3.2. Glycerin (unverdünnt, Viskosität: 1 490 cP)

2.1.2.1.3.3. Norland ® Optical Adhesive 65 (Viskosität: 1 200 cP) oder ein Harz mit gleichwertigen Eigenschaften für Dauerpräparate

2.1.2.1.4. Färbende Einbettungsmedien

2.1.2.1.4.1. Lugolsche Lösung (2 g Kaliumiodid in 100 ml Wasser lösen und unter häufigem Schütteln 1 g Iod zufügen)

2.1.2.1.4.2. Cystin-Reagenz (2 g Bleiacetat, 10 g NaOH/100 ml Wasser)

2.1.2.1.4.3. Fehlingsche Lösung (vor Gebrauch aus äquivalenten Teilen zweier Stammlösungen a und B zubereitet. Lösung A: 6,9 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat in 100 ml Wasser lösen. Lösung B: 34,6 g Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat und 12 g NaOH in 100 ml Wasser lösen)

2.1.2.1.4.4. Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxid (1 g 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) in 100 ml Eisessig und 150 ml Wasser lösen. Vor Gebrauch 4 Teile dieser TMB-Lösung mit 1 Teil 3 %igem Wasserstoffperoxid mischen)

2.1.2.1.5. Spülmittel

2.1.2.1.5.1. Ethanol ≥ 96 % (technische Qualität)

2.1.2.1.5.2. Aceton (technische Qualität)

2.1.2.1.6. Bleichmittel

2.1.2.1.6.1. Handelsübliche Natriumhypochlorit-Lösung (9-14 % aktives Chlor)

2.1.2.2. Geräte

2.1.2.2.1. Analysenwaage mit einer Genauigkeit von 0,001 g

2.1.2.2.2. Zerkleinerungsgeräte: Mühle oder Mörser

2.1.2.2.3. Siebe mit rechteckigen Maschen von 0,25 und 1 mm Weite

2.1.2.2.4. Gläserner Scheidetrichter von 250 ml mit konischem Boden, unten verschlossen mit einem Absperrhahn aus Teflon oder Schliffglas. Öffnung im Absperrhahn ≥ 4 mm Durchmesser. Alternativ kann auch ein Absetzbecher mit konischem Boden verwendet werden, wenn das Labor bewiesen hat, dass die Nachweisgrenzen denjenigen bei Verwendung des Scheidetrichters gleichwertig sind.

Scheidetrichter

2.1.2.2.5. Stereo-Auflicht-Mikroskop mit 6,5- bis 40-facher Vergrößerung

2.1.2.2.6. Zusammengesetztes Mikroskop mit mindestens 100- bis 400-facher Vergrößerung, mit Hellfeld-Durchlicht. Zusätzlich können auch Verfahren mit polarisiertem Licht und Differenzial-Interferenzkontrast eingesetzt werden

2.1.2.2.7. Standardmäßige Laborglasausrüstung

2.1.2.2.8. Ausrüstung für die Objektträgervorbereitung: herkömmliche Objektträger, Hohlschliff-Objektträger, Deckgläser (20x20 mm), Pinzette, feiner Spatel

2.1.3. Probenahme und Probenvorbereitung

2.1.3.1. Probenahme

Untersucht wird eine repräsentative Probe, die nach der Beschreibung in Anhang I entnommen wurde.

2.1.3.2. Vorsichtsmaßnahmen

Um eine Kreuzkontamination im Labor zu vermeiden, sind sämtliche wiederverwendbaren Geräte sorgfältig zu reinigen. Scheidetrichter werden vor dem Reinigen in ihre Einzelteile zerlegt. Glas- und sonstige Teile der Scheidetrichter werden von Hand vorgewaschen und dann in der Spülmaschine gewaschen. Siebe sind mit einer Bürste mit steifen Synthetikborsten zu reinigen. Nach dem Sieben von fetthaltigem Material wie Fischmehl ist eine abschließende Reinigung der Siebe mit Aceton und Druckluft zu empfehlen.

2.1.3.3. Vorbereitung von anderen Proben als Fett und Öl

2.1.3.3.1.Trocknung der Proben:Proben mit einem Feuchtigkeitsgehalt > 14 % werden vor Gebrauch getrocknet.

2.1.3.3.2.Vorsieben der Proben: Es wird empfohlen, pelletierte Futtermittel und Kerne bis zu einer Größe von 1 mm vorzusieben und die beiden Fraktionen dann als unterschiedliche Proben zu präparieren und zu untersuchen.

2.1.3.3.3.Herstellung von Teilproben und Zerkleinern: Von mindestens 50 g der Probe werden Teilproben für die Untersuchung hergestellt und anschließend zerkleinert.

2.1.3.3.4.Extraktion und Vorbereitung des Sediments: 10 g (bis auf 0,01 g genau) der zerkleinerten Teilprobe werden in den Scheidetrichter bzw. Absetzbecher mit konischem Boden gegeben und mit 50 ml Tetrachlorethylen ergänzt. Bei Fischmehl oder anderen reinen Tierprodukten, mineralischen Zutaten oder Vormischungen mit mehr als 10 % Sediment wird nur eine Menge von 3 g in den Trichter gegeben. Das Gemisch mindestens 30 s lang kräftig schütteln; dann vorsichtig mindestens 50 ml Tetrachlorethylen hinzufügen, wobei darauf zu achten ist, dass von der Innenwand des Trichters sämtliche anhaftenden Partikel abgespült werden. Die entstandene Lösung mindestens 5 min stehen lassen und dann das Sediment durch Öffnen des Absperrhahns abscheiden.

Bei Gebrauch eines Absetzbechers mit konischem Boden das Gemisch mindestens 15 s kräftig schütteln; an der Innenseite des Bechers haftende Partikel mit mindestens 10 ml reinem Tetrachlorethylen sorgfältig in das Gefäß hineinspülen. Die Lösung 3 min stehen lassen und wieder 15 s schütteln; noch an der Innenseite des Bechers haftende Partikel mit mindestens 10 ml reinem Tetrachlorethylen sorgfältig hineinspülen. Die entstandene Lösung mindestens 5 min stehen lassen; dann die flüssige Fraktion durch vorsichtiges Abgießen trennen und beseitigen, wobei das Sediment vollständig erhalten bleiben muss.

Das Sediment wird getrocknet und anschließend ausgewogen (auf 0,001 g genau). Bestehen mehr als 5 % des Sediments aus Partikeln über 0,50 mm, wird es auf eine Partikelgröße von 0,25 mm heruntergesiebt; beide Fraktionen werden untersucht.

2.1.3.3.5.Extraktion und Vorbereitung des Flotats Nach Erhalt des Sediments mit der oben beschriebenen Methode sollten zwei Phasen im Scheidetrichter verbleiben:eine aus Tetrachlorethylen bestehende flüssige Phase und eine aus aufschwimmendem Material bestehende feste Phase. Diese feste Phase ist das Flotat, das gewonnen wird, indem man das Tetrachlorethylen durch Öffnen des Absperrhahns vollständig ablaufen lässt. Das Flotat wird aus dem Scheidetrichter in eine große Petrischale gekippt und im Abzug luftgetrocknet. Bestehen mehr als 5 % des Flotats aus Partikeln über 0,50 mm, wird es auf eine Partikelgröße von 0,25 mm heruntergesiebt; beide Fraktionen werden untersucht.

2.1.3.3.6.Vorbereitung von Ausgangsmaterial: Eine Menge von mindestens 5 g der zerkleinerten Teilprobe präparieren. Bestehen mehr als 5 % des Materials aus Partikeln über 0,50 mm, wird es auf eine Partikelgröße von 0,25 mm heruntergesiebt; beide Fraktionen werden untersucht.

2.1.3.4. Vorbereitung von Proben aus Fett und Öl

Für die Vorbereitung von Proben aus Fett oder Öl gilt folgender Ablauf:

• Handelt es sich um festes Fett, wird es in einem Ofen erhitzt, bis es flüssig ist;
• der Probe werden mittels einer Pipette am Boden 40 ml Fett oder Öl entnommen und in ein Zentrifugenröhrchen gegeben;
• 10 min bei 4 000/min zentrifugieren;
• ist das Fett nach dem Zentrifugieren fest, wird es in einem Ofen erhitzt, bis es flüssig ist;
• dann erneut 5 min lang bei 4 000/min zentrifugieren;
• mit Hilfe eines kleinen Löffels oder eines Spatels eine Hälfte der abgegossenen Verunreinigungen zur mikroskopischen Untersuchung auf Objektträger aufbringen; als Einbettungsmedium wird Glycerin empfohlen;
• den Rest der Verunreinigungen zur Vorbereitung des Sediments nach der Beschreibung unter 2.1.3.3 verwenden.

2.1.3.5. Gebrauch von Nachweisreagenzien

Zur korrekten Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs kann der Untersucher bei der Probenvorbereitung Färbereagenzien verwenden, wie das EURL-AP dies in den auf seiner Website veröffentlichten Leitlinien beschrieben hat.

Bei Verwendung von Alizarinrot-Lösung zum Färben des Sediments gilt folgender Ablauf:

• Das getrocknete Sediment in ein Reagenzglas füllen und 2-mal mit etwa 5 ml Ethanol spülen (jedes Mal 30 s durchmischen, nach etwa 1 min 30 s Absetzzeit wird das Lösungsmittel abgegossen);
• das Sediment durch Zusatz von mindestens 1 ml Natriumhypochloritlösung bleichen. 10 min reagieren lassen. Danach das Reagenzglas mit Wasser füllen, nach einer Absetzzeit des Sediments von 2-3 min das Wasser und die suspendierten Partikel vorsichtig abschütten;
• das Sediment noch 2-mal mit etwa 10 ml Wasser spülen (30 s durchmischen, absetzen lassen und das Wasser jedes Mal abgießen);
• 2 bis 10 Tropfen Alizarinrot-Lösung hinzugeben und durchmischen. 30 s reagieren lassen, dann das gefärbte Sediment 2-mal mit etwa 5 ml Ethanol und einmal mit Aceton spülen (jedes Mal 30 s durchmischen, die Lösung etwa 1 min absetzen lassen und abgießen);
• das gefärbte Sediment trocknen.

2.1.4. Mikroskopische Untersuchung

2.1.4.1. Vorbereitung der Objektträger

Von dem Sediment und, je nach Präferenz des Untersuchers, von dem Flotat oder dem Ausgangsmaterial werden Objektträger präpariert. Wurde die Probe bei der Vorbereitung gesiebt, werden die beiden entstandenen Fraktionen (fein und grob) präpariert. Die zur Untersuchung auf die Träger gestrichenen Teile der Fraktionen sind repräsentativ für die gesamte Fraktion.

Die Zahl der präparierten Träger muss ausreichen, um einen kompletten Untersuchungsablauf nach 2.1.4.2 ausführen zu können.

Die Objektträger werden nach der vom EURL-AP ausgearbeiteten und auf seiner Website veröffentlichten
SOP mit dem passenden Einbettungsmedium eingedeckt. Auf den Trägern werden Deckgläser platziert.

2.1.4.2. Untersuchungsablauf für den Nachweis tierischer Partikel in Mischfuttermitteln und Einzelfuttermitteln

Die präparierten Objektträger werden nach den in den Abbildungen 1 (Mischfuttermittel und Einzelfuttermittel, außer reines Fischmehl) und 2 (reines Fischmehl) festgelegten Abläufen untersucht.

Die mikroskopische Untersuchung des Sediments und, je nach Präferenz des Untersuchers, des Flotats oder des Ausgangsmaterials wird mit dem zusammengesetzten Mikroskop durchgeführt. Für die groben Fraktionen kann zusätzlich auch ein Stereomikroskop benutzt werden. Jedes Präparat wird mit unterschiedlicher Vergrößerung vollständig abgesucht.

In jedem Schritt des Ablaufs ist die festgelegte Mindestzahl von Präparaten zu untersuchen, es sei denn, das gesamte Material der Fraktion reicht dafür nicht aus. Bei jeder Bestimmung werden höchstens 6 Präparate untersucht.

Für die Bestimmung von Art und Ursprung der Partikel kann der Untersucher Hilfsinstrumente wie Systeme zur Unterstützung der Entscheidungsfindung, Bildarchive und Referenzproben hinzuziehen.

Abbildung 1: Untersuchungsabläufe für den Nachweis tierischer Partikel in Mischfuttermitteln und Einzelfuttermitteln, außer Fischmehl

Abbildung 2: Untersuchungsablauf für den Nachweis tierischer Partikel in Fischmehl

2.1.4.3. Anzahl der Bestimmungen

Wird im ersten Durchgang gemäß dem in den Abbildungen 1 bzw. 2 beschriebenen Ablauf kein tierisches Partikel spezifischer Art (d. h. von Landtier oder Fisch) nachgewiesen, sind keine weiteren Bestimmungen erforderlich, und über das Ergebnis der Analyse wird unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.1 berichtet.

Werden im ersten Durchgang gemäß dem in den Abbildungen 1 bzw. 2 beschriebenen Ablauf insgesamt zwischen 1 und 5 tierische Partikel spezifischer Art (d. h. von Landtier oder Fisch) nachgewiesen, wird eine zweite Bestimmung mit einer neuen Teilprobe von 50 g durchgeführt. Werden im zweiten Durchgang zwischen 0 und 5 tierische Partikel dieser spezifischen Art nachgewiesen, wird über das Ergebnis der Analyse unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.2 berichtet; anderenfalls wird eine dritte Bestimmung mit einer neuen Teilprobe von 50 g durchgeführt. Liegt nach der ersten und zweiten Bestimmung die Summe der in beiden Durchgängen nachgewiesenen Partikel spezifischer Art jedoch über 15, ist keine weitere Bestimmung erforderlich und über das Ergebnis der Analyse wird unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.3 direkt berichtet. Liegt nach der dritten Bestimmung die Summe der in den drei Durchgängen nachgewiesenen tierischen Partikel spezifischer Art jedoch über 15, wird über das Ergebnis der Analyse unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.3 berichtet. Anderenfalls wird über das Ergebnis der Analyse unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.2 berichtet.

Werden im ersten Durchgang gemäß dem in den Abbildungen 1 bzw. 2 beschriebenen Ablauf mehr als 5 tierische Partikel spezifischer Art (d. h. von Landtier oder Fisch) nachgewiesen, wird über das Ergebnis der Analyse unter Verwendung der Formulierung in Nummer 2.1.5.3 berichtet.

2.1.5. Formulierung der Ergebnisse

In seinem Bericht über die Ergebnisse gibt das Labor an, welche Art von Material (Sediment, Flotat oder Ausgangsmaterial) analysiert und wieviele Bestimmungen durchgeführt wurden.

Der Laborbericht enthält zumindest Informationen über das Vorhandensein von Bestandteilen, die von Landtieren oder von Fisch stammen.

Die verschiedenen Fälle werden wie folgt dargestellt:

2.1.5.1. Kein tierisches Partikel spezifischer Art nachgewiesen:

• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurde in der vorliegenden Probe kein Partikel von Landtieren nachgewiesen;
• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurde in der vorliegenden Probe kein Partikel von Fisch nachgewiesen.

2.1.5.2. Im Schnitt zwischen 1 und 5 tierische Partikel spezifischer Art nachgewiesen:

• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurden in der vorliegenden Probe im Schnitt bei jeder Bestimmung nicht mehr als 5 von Landtieren stammende Partikel nachgewiesen. Die Partikel wurden als ... [Knochen, Knorpel, Muskelgewebe, Haare, Horn usw.] erkannt. Wegen dieser geringen Zahl, die unter der Nachweisgrenze der mikroskopischen Methode liegt, kann das Risiko eines falsch positiven Ergebnisses nicht ausgeschlossen werden.

Oder gegebenenfalls:

• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurden in der vorliegenden Probe im Schnitt bei jeder Bestimmung nicht mehr als 5 von Fisch stammende Partikel nachgewiesen. Die Partikel wurden als ... [Gräten, Schuppen, Knorpel, Muskelgewebe, Otolith, Kiemen usw.] erkannt. Wegen dieser geringen Zahl, die unter der Nachweisgrenze der mikroskopischen Methode liegt, kann das Risiko eines falsch positiven Ergebnisses nicht ausgeschlossen werden.

Wurde die Probe zuvor gesiebt, gibt das Labor an, in welcher Fraktion (gesiebt, pelletiert oder Kerne) die tierischen Partikel nachgewiesen wurden, da nur in der gesiebten Fraktion nachgewiesene tierische Partikel auf eine Umweltkontamination hindeuten können.

2.1.5.3. Im Schnitt mehr als 5 tierische Partikel spezifischer Art nachgewiesen:

• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurden in der vorliegenden Probe im Schnitt bei jeder Bestimmung mehr als 5 von Landtieren stammende Partikel nachgewiesen. Die Partikel wurden als ... [Knochen, Knorpel, Muskelgewebe, Haare, Horn usw.] erkannt.

Oder gegebenenfalls:

• Soweit mit dem Lichtmikroskop erfassbar, wurden in der vorliegenden Probe im Schnitt bei jeder Bestimmung mehr als 5 von Fisch stammende Partikel nachgewiesen. Die Partikel wurden als ... [Gräten, Schuppen, Knorpel, Muskelgewebe, Otolith, Kiemen usw.] erkannt.

Wurde die Probe zuvor gesiebt, gibt das Labor an, in welcher Fraktion (gesiebt, pelletiert oder Kerne) die tierischen Partikel nachgewiesen wurden, da nur in der gesiebten Fraktion nachgewiesene tierische Partikel auf eine Umweltkontamination hindeuten können.

2.2. PCR

2.2.1. Grundsatz

Aus Desoxyribonucleinsäure (DNA) bestehende Fragmente tierischen Ursprungs, die in Einzelfuttermittel und Mischfuttermitteln vorhanden sein können, werden durch PCR mit einer Genamplifikationstechnik nachgewiesen, die nach tierartspezifischen DNA-Sequenzen sucht.

Für die PCR-Methode muss zunächst DNa extrahiert werden. Der Amplifikationsschritt wird anschließend an dem so erhaltenen DNA-Extrakt durchgeführt, um die Tierart nachzuweisen, auf die untersucht wird.

2.2.2. Reagenzien und Geräte

2.2.2.1. Reagenzien

2.2.2.1.1. Reagenzien für die DNA-Extraktion

Nur vom EURL-AP genehmigte und auf dessen Website veröffentlichte Reagenzien dürfen verwendet werden.

2.2.2.1.2. Reagenzien für die genetische Amplifikation

2.2.2.1.2.1. Primer und Sonden

Nur Primer und Sonden mit vom EURL-AP validierten Oligonucleotid-Sequenzen dürfen verwendet werden ².

2.2.2.1.2.2. Master Mix

Nur Master-Mix-Lösungen ohne Reagenzien, die zu falschen Ergebnissen führen können, dürfen verwendet werden ³.

2.2.2.1.2.3. Dekontaminations-Reagenzien

2.2.2.1.2.3.1. Salzsäure-Maßlösung (0,1 N)

2.2.2.1.2.3.2. Bleichmittel (Natriumhypochlorit-Lösung, 0,15 % aktives Chlor)

2.2.2.1.2.3.3. Nicht ätzende Reagenzien für die Dekontamination kostspieliger Geräte wie Analysewaagen (z.B. DNa Erase^TM von MP Biomedicals)

2.2.2.2. Geräte

2.2.2.2.1. Analysenwaage mit einer Genauigkeit von 0,001 g

2.2.2.2.2. Zerkleinerungsgeräte

2.2.2.2.3. Thermocycler für Echtzeit-PCR

2.2.2.2.4. Mikrozentrifuge für entsprechende Reaktionsgefäße

2.2.2.2.5. Satz von Mikropipetten für das Pipettieren von 1 bis 1 000 µl

2.2.2.2.6. In der Molekularbiologie übliche Verbrauchsmaterialien: Mikrozentrifugen-Röhrchen, Kunststofffilterspitzen für Mikropipetten, geeignete Reaktionsgefäße für den Thermocycler

2.2.2.2.7. Kühlschränke für die Lagerung von Proben und Reagenzien

2.2.3. Probenahme und Probenvorbereitung

2.2.3.1. Probenahme

Untersucht wird eine repräsentative Probe, die nach der Beschreibung in Anhang I entnommen wurde.

2.2.3.2. Probenvorbereitung

Die Vorbereitung von Laborproben bis hin zur Extraktion der DNa entspricht den Anforderungen in Anhang II. Von mindestens 50 g der Probe werden Teilproben für die Untersuchung hergestellt und anschließend zerkleinert.

Die Proben werden gemäß ISO 24276 in einem anderen als den Räumen vorbereitet, in denen DNa extrahiert und vermehrt wird.

Es werden zwei Testmengen zu je mindestens 100 mg vorbereitet.

2.2.4. Extraktion der DNA

Die DNa wird nach der vom EURL-AP ausgearbeiteten und auf seiner Website veröffentlichten SOP aus beiden Testmengen extrahiert.

Für jede Extraktionsserie werden nach ISO 24276 zwei Extraktionskontrollen vorbereitet:

• eine Extraktionsblindkontrolle,
• eine positive DNA-Extraktionskontrolle.

2.2.5. Genetische Amplifikation

Die genetische Amplifikation geschieht anhand von Methoden, die für die zu bestimmenden Tierarten validiert wurden. Diese Methoden sind in der vom EURL-AP ausgearbeiteten und auf seiner Website veröffentlichten SOP beschrieben. Jedes DNA-Extrakt ist in mindestens zwei unterschiedlichen Verdünnungen zu untersuchen, um die Inhibition zu bewerten.

Für jede Zieltierart werden nach ISO 24276 zwei Amplifikationskontrollen vorbereitet:

• für jede Schale oder PCR-Versuchsreihe eine positive DNA-Zielkontrolle,
• für jede Schale oder PCR-Versuchsreihe eine Kontrolle der Amplifikationsreagenzien (auch no template control).

2.2.6. Interpretation und Formulierung der Ergebnisse

Bei der Berichterstattung über die Ergebnisse gibt das Labor zumindest das Gewicht der Testmengen, die Extraktionstechnik, die Zahl der durchgeführten Bestimmungen und die Nachweisgrenze der Methode an.

Ergebnisse werden nicht interpretiert und berichtet, wenn die positive DNA-Extraktionskontrolle und die positiven DNA-Zielkontrollen keine positiven Ergebnisse für das gesuchte Ziel ergeben und die Amplifikationsreagenz-Kontrolle gleichzeitig negativ ist.

Stimmen die Ergebnisse der beiden Testmengen nicht überein, ist zumindest die genetische Amplifikation zu wiederholen. Geht das Labor davon aus, dass dies an den DNA-Extrakten liegen kann, wird vor der Interpretation der Ergebnisse erneut DNa extrahiert und vermehrt.

Die abschließende Formulierung der Ergebnisse stützt sich auf die Integration und Interpretation der Ergebnisse der beiden Testmengen nach der vom EURL-AP ausgearbeiteten und auf seiner Website veröffentlichten SOP.

2.2.6.1. Negatives Ergebnis

Über ein negatives Ergebnis wird wie folgt berichtet:

In der vorliegenden Probe wurde keine DNa von X nachgewiesen (wobei X die Tierart oder Gruppe von Tierarten ist, auf die untersucht wird).

2.2.6.2. Positives Ergebnis

Über ein positives Ergebnis wird wie folgt berichtet:

In der vorliegenden Probe wurde DNa von X nachgewiesen (wobei X die Tierart oder Gruppe von Tierarten ist, auf die untersucht wird).

_______
1) http://eurl.craw.eu/

2) Die Liste dieser Primer und Sonden für die einzelnen gesuchten Tierarten findet sich auf der Website des EURL-AP.

3) Beispiele brauchbarer Master Mixes finden sich auf der Website des EURL-AP.

.

1. Berechnungsmethode und Formel des Energiegehalts

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln für Geflügel wird anhand der prozentualen Anteile bestimmter analytischer Bestandteile der Futtermittel nach nachstehender Formel berechnet. Dieser Wert wird in Megajoules (MJ) umsetzbarer, N-korrigierter Energie (ME) je kg Mischfuttermittel ausgedrückt und nach folgender Formel berechnet:

MJ ME/kg = 0,1551 × % Rohprotein + 0,3431 × % Rohfett + 0,1669 × % Stärke + 0,1301 × % Gesamtzucker (ausgedrückt als Saccharose).

2. Toleranzen auf die angegebenen Gehalte

Ergibt sich bei den amtlichen Untersuchungen eine energieerhöhende oder energievermindernde Abweichung zwischen dem Kontrollergebnis und dem angegebenen Gehalt, so gilt eine Mindesttoleranz von 0,4 MJ ME/kg.

3. Ausdruck der Ergebnisse

Das nach vorstehender Formel errechnete Ergebnis ist mit nur einer Dezimalstelle anzugeben.

4. Probenahmeverfahren und Analysemethoden

Die Probenahme beim Mischfuttermittel und die Bestimmung des Gehalts an der Berechnungsmethode zugrundeliegenden analytischen Bestandteilen erfolgt in Übereinstimmung mit den gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren bzw. Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln.

Anzuwenden sind:

• für die Bestimmung des Rohfettgehalts: Verfahren B der Methode zur Bestimmung des Gehalts an Rohölen und -fetten, wie in Anhang III Teil H beschrieben;
• für die Bestimmung des Stärkegehalts: die polarimetrische Methode wie in Anhang III Teil L beschrieben.

weiter .