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Bestimmung der Toxizität

Teil C: Methoden zur Bestimmung der Ökotoxizität

Allgemeine Einleitung: Teil C

Die nachstehend beschriebenen Prüfmethoden dienen dem Nachweis einiger der in Anhang VII und Anhang VIII angegebenen ökotoxischen Eigenschaften. Die Anmelder sollten sich im klaren darüber sein, daß dieser Text keine Methoden zum Nachweis der folgenden Eigenschaften unter Stufe 1 von Anhang VIII umfaßt:

• lingerdauernde Toxizitätsuntersuchungen mit Daphnia magna;
• Prüfungen an höheren Pflanzen,
• längerdauernde Toxizitätsuntersuchungen an Fischen
• Akkumulationsprüfungen mit bestimmten Arten.

Methoden zum Nachweis dieser Eigenschaften werden nach ihrer endgültigen Abfassung in der Form einer weiteren Anpassung an den technischen Fortschritt veröffentlicht. Bis dahin sollten die Anmelder international anerkannte Methoden anwenden, die der zuständigen Behörde anzugeben sind.

zur aktuellen Fassung

C.1. 1. Methode

C.1. 1.1. Einleitung

Mit diesem Test soll die akute letale Toxizität einer Substanz für Fische in Süßwasser bestimmt werden. Soweit wie möglich sollten Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubarkeit der Substanz vorhanden sein, um die Auswahl der am besten geeigneten Prüfmethode (statisch, semistatisch oder im Durchfluß) zur Sicherstellung ausreichend konstanter Konzentrationen der Prüfsubstanz während des gesamten Prüfzeitraums zu erleichtern.

Weitere Angaben (z.B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Prozentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und Menge von Zusätzen, sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.

C.1. 1.2. Definitionen und Einheiten

Unter akuter Toxizität wird die deutlich erkennbare schädigende Wirkung verstanden, die in einem Organismus innerhalb kurzer Zeit (Tage) durch Einwirkung (Exposition) eines Stoffes hervorgerufen wird. In der vorliegenden Prüfung wird die akute Toxizität als die mittlere letale Konzentration (LC₅₀) ausgedrückt; das ist die Konzentration im Wasser, die 50 % einer Prüfgruppe von Fischen innerhalb einer anzugebenden ununterbrochenen Einwirkungsdauer tötet.

Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen (mg/l) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg/kg) angegeben werden.

C.1. 1.3. Referenzsubstanzen

Eine Referenzsubstanz kann geprüft werden, um nachzuweisen, daß sich die Reaktion des Prüfsystems unter den Bedingungen der Prüfeinrichtung nicht wesentlich geändert hat.

Referenzsubstanzen sind für diesen Test noch nicht festgelegt.

C.1. 1.4. Prinzip der Methode

Es kann ein Limit-Test mit 100 mg/l durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die LC₅₀ über dieser Konzentration liegt.

Die Fische werden der dem Wasser zugesetzten Prüfsubstanz für einen Zeitraum von 96 Stunden verschiedenen Konzentration ausgesetzt. Die Mortalitäten werden mindestens alle 24 Stunden erfaßt; soweit möglich, werden bei jeder Beobachtung auch die Konzentrationen berechnet, die 50 % der Fische töten (LC₅₀).

C.1. 1.5. Qualitätskriterien

Die Qualitätskriterien gelten für den Limit-Test als auch für das vollständige Prüfverfahren.

Die Mortalität darf bei den Kontroll-Prüfsystemen am Ende der Prüfung 10 % (bzw. einen Fisch, wenn weniger als 10 verwendet werden) nicht überschreiten.

Die Sauerstoffkonzentration muß über die gesamte Prüfdauer mehr als 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts betragen.

Die Konzentrationen der Prüfsubstanz sollen über den gesamten Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentrationen gehalten werden.

Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem Masse verflüchtigen oder nicht in einem solchen Masse abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es ist nachzuweisen, daß die Konzentrationen über den gesamten Prüfzeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfüllt worden sind.

Bei Substanzen, die

1. im Prüfmedium schwer löslich sind oder
2. stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder
3. in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind, soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei Prüfbeginn in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen worden ist. Die Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung, jedoch vor Einbringen der Prüforganismen bestimmt werden.

In all diesen Fällen müssen weitere Messungen im Verlauf der Prüfung durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Expositionskonzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfüllt worden sind.

Der pH-Wert darf nicht um mehr als eine Einheit schwanken.

C.1. 1.6. Beschreibung der Methode

Für die Durchführung der Prüfung aufgrund der vorliegenden Methode sind drei Verfahren möglich:

Statisches Verfahren:

Toxizitätsprüfung wobei das Prüfmedium während der Prüfdauer nicht erneuert wird.

Semistatisches Verfahren:

Das Prüfmedium wird regelmäßig nach einem längeren Zeitraum (z.B. 24 Stunden) vollständig ausgewechselt.

Durchflußverfahren:

Das Prüfmedium wird ständig erneuert, wobei die Prüfsubstanz mit dem Wasser für die Erneuerung des Prüfmediums eingebracht wird.

C.1. 1.6.1. Reagenzien

C.1. 1.6.1.1. Lösungen der Prüfsubstanzen

Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser entsprechend 1.6.1.2. hergestellt.

Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Verdünnung des Stammansatzes zubereitet. Bei hohen Konzentrationen kann die Prüfsubstanz unmittelbar im Verdünnungswasser gelöst werden.

Die Substanzen sollten im allgemeinen nur bis zur Löslichkeitsgrenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z.B. bei solchen mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem Pow oder solchen, die im Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt, um sicherzustellen, daß die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, daß diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z.B. durch Bildung eines Substanzfilms auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).

Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche Menge des Hilfsstoffes enthalten und müssen zusätzliche Kontroll-Fische derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration derartiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall jedoch 100 mg/l im Prüfmedium überschreiten.

Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wiederholen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Verdünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muß so erfolgen, daß sich die Konzentration der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physikalische Ausfällung der Prüfsubstanz ergeben, so muß diese Beobachtung im Prüfbericht protokolliert werden.

C.1. 1.6.1.2. Hälterungs- und Verdünnungswasser

Verwendet werden kann Leitungswasser (Trinkwasser) (nicht verunreinigt durch potentiell schädliche Konzentrationen an Chlor, Schwermetallen oder anderen Substanzen), einwandfreies natürliches Wasser oder zubereitetes Wasser (siehe Anlage 1). Am besten geeignet sind Wasserqualitäten mit einer Gesamthärte zwischen 10 und 250 mg/l (bezogen auf CaCO₃) und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,5.

C.1. 1.6.2. Geräte

Alle Geräte müssen aus chemisch inertem Material bestehen:

• Einrichtungen zur automatischen Verdünnung (für das Durchfluß-Verfahren);
• Sauerstoffmeßgerät;
• Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte;
• geeignetes Gerät zur Temperaturmessung;
• pH-Meßgerät.

C.1 . 1.6.3 . Prüforganismen

Die Fische müssen in guter gesundheitlicher Verfassung sein und dürfen keine offensichtlichen Mißbildungen aufweisen.

Es wird empfohlen, die verwendeten Arten nach so wichtigen praktischen Kriterien wie ihrer Verfügbarkeit im ganzen Jahr, ihrer problemlosen Hälterung, ihrer Eignung für Prüfzwecke, ihrer relativen Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien sowie anderen ökonomisch, biologisch oder ökologisch bedeutsamen Faktoren auszuwählen. Außerdem sollten bei der Auswahl der Fischarten die Notwendigkeit der Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten und die bestehende internationale Harmonisierung (vgl. (1)) berücksichtigt werden.

Eine Liste der für die Prüfung empfohlenen Fischarten ist in Anlage 2 enthalten; bevorzugt verwendet werden Zebrabärblinge und Regenbogenforelle.

C.1. 1.6.3.1. Hälterung

Die Fische sollten möglichst aus einer einzigen Charge bei etwa gleicher Länge und gleichem Alter stammen. Sie müssen mindestens 12 Tage unter folgenden Bedingungen gehältert werden:

Besatz: entsprechend dem Verfahren (Umwälzanlage oder Durchfluß) und der Fischart;

Wasser: siehe 1.6.1.2.;

Beleuchtung: 12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich;

Konzentration an gelöstem Sauerstoff: mindestens 80 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts;

Fütterung: Dreimal wöchentlich oder täglich, Aussetzung der Fütterung 24 Stunden vor Beginn der Fütterung.

C.1. 1.6.3.2. Mortalität

Nach einer Eingewöhnungszeit von 48 Stunden wird die Mortalität unter Anwendung folgender Kriterien erfaßt:

• bei mehr als 10 % der Population in sieben Tagen:
  die Charge ist nicht verwendbar für den Test;
• zwischen 5 und 10 % der Population:
  die Hälterungszeit ist weitere sieben Tage fortzusetzen. Treten keine weiteren Sterbefälle auf, ist die Charge für die Prüfung verwendbar, ansonsten nicht;
• bei 5 % und weniger der Population
  die Charge ist für die Prüfung verwendbar.

C.1. 1.6.4. Anpassung

Alle Fische sind für eine Mindestdauer von sieben Tagen vor ihrem Einsatz in der Prüfung in Wasser derselben Qualität und bei der gleichen Temperatur einzusetzen, wie es in der Prüfung verwendet wird.

C.1. 1.6.5. Durchführung der Prüfung

Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorangehen. Dieser Vorversuch liefert Informationen über den in der eigentlichen Prüfung zu verwendenden Konzentrationsbereich.

Zusätzlich zu den Konzentrationen der Prüfsubstanz sind eine Kontrolle ohne die Prüfsubstanz und ggf. eine Kontrolle mit dem Hilfsstoff einzusetzen.

In Abhängigkeit von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz ist zur Erfüllung der Qualitätskriterien eine Prüfung in einem statischen, semistatischen oder Durchfluß-Verfahren auszuwählen.

Die Fische werden der Prüfsubstanz wie im folgenden beschrieben ausgesetzt:

• Dauer: 96 Stunden;
• Anzahl der Tiere: mindestens 7 je Konzentration;
• Behälter: geeignetes Fassungsvermögen im Verhältnis zum empfohlenen Besatz;
• Besatz: Als Höchstbesatz werden im statischen und semistatischen Verfahren 1,0 g/l empfohlen; im Durchfluß-Verfahren ist ein höherer Besatz möglich;
• Prüfkonzentration: mindestens fünf Konzentrationen, die sich durch einen konstanten Faktor unterscheiden, der 2,2 nicht überschreiten darf, und die den Bereich von 0 % bis 100 % Mortalität soweit wie möglich umfassen;
• Wasser: siehe 1.6.1.2.;
• Beleuchtung: 12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich;
• Temperatur: entsprechend der Fischart (Anlage 2), jedoch innerhalb ± 1 °C bei jeder einzelnen Prüfung;
• Konzentration an gelöstem Sauerstoff: nicht unter 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes bei der gewählten Temperatur;
• Fütterung: keine.

Die Fische werden nach den ersten 2-4 Stunden und mindestens alle 24 Stunden beobachtet. Ein Fisch gilt als tot, wenn bei Berührung des Schwanzansatzes keine Reaktion erfolgt und wenn keine Atembewegungen erkennbar sind. Tote Fische sind, sobald sie bemerkt werden, zu entfernen und entsprechend zu protokollieren.

Für den Prüfbericht sind außerdem weitere sichtbare Veränderungen zu erfassen (z.B. Gleichgewichtsverlust, Änderungen des Schwimmverhaltens, der Atmung, der Pigmentierung, usw.)

Messungen des pH-Wertes, des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und der Temperatur müssen täglich erfolgen.

Limit-Test

Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Methoden kann ein Limit-Test mit 100 mg/l durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die LC₅₀ über dieser Konzentration liegt.

Wenn die Substanz so beschaffen ist, daß eine Konzentration von 100 mg/l im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit-Test mit einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Dispersion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch Punkt 1.6.1.1.).

Im Limit-Test sollten 7 bis 10 Fische untersucht und die gleiche Anzahl als Kontrollen verwendet werden. (Nach dem Binomischen Lehrsatz liegt bei Verwendung von 10 Fischen mit Null-Mortalität die Wahrscheinlichkeit bei 99,9 %, daß die LC₅₀ höher ist als die im Limit-Test verwendete Konzentration. Bei 7, 8 oder 9 Fischen ergibt eine Null-Mortalität eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 99 %, daß die LC₅₀ höher ist als die verwendete Konzentration).

Bei Vorliegen von Sterbefällen ist das vollständige Verfahren anzuwenden. Wenn subletale Wirkungen beobachtet werden, sind diese zu protokollieren.

C.1. 2. Daten und Auswertung

Die Mortalität wird für jeden Zeitraum, in dem Beobachtungen protokolliert wurden (24, 48, 72 und 96 Stunden), für jede empfohlene Expositionsdauer auf Wahrscheinlichkeits- (Probit-)papier (mit logarithmischer Einteilung) gegen die Konzentration aufgetragen.

Soweit möglich, sollten die LC₅₀ und der jeweilige Vertrauensbereich (p = 0,05) für jeden Beobachtungszeitraum nach Standardverfahren ermittelt werden. Diese Werte sind auf eine oder höchstens zwei signifikante Stelle(n) zu runden (Beispiele für das Runden auf zwei Stellen: 170 für 173,5; 0,13 für 0,127; 1,2 für 1,21).

Sollte der Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für eine Berechnung der LC₅₀ zu steil sein, so reicht eine graphische Abschätzung dieses Wertes.

Ergeben zwei unmittelbar aufeinanderfolgende Konzentrationen, die sich durch den Faktor 2,2 unterscheiden, nur 0 % und 100 % Mortalität, so werden diese beiden Werte zur Angabe des Bereichs, in den die LC₅₀ fällt, herangezogen.

Wird beobachtet, daß die Stabilität oder Homogenität der Prüfsubstanz nicht aufrechterhalten werden kann, so ist dies im Prüfbericht mitzuteilen und bei der Interpretation der Ergebnisse entsprechend zu berücksichtigen.

C.1. 3. Abschlußbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• Angaben über die verwendeten Fische (wissenschaftlicher Name, Stamm, Züchter oder Bezugsquelle, Vorbehandlungen, Größe und Anzahl der einzelnen Prüfkonzentrationen);
• Herkunft des Verdünnungswassers und wichtige chemische Eigenschaften (pH-Wert, Härte, Temperatur);
• Bei Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit: Angabe der Methode zur Herstellung des Stammansatzes und der Prüflösungen;
• Konzentration aller Hilfsstoffe;
• Liste der verwendeten Konzentrationen sowie alle vorhandenen Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz in der Prüflösung bei den verwendeten Konzentrationen;
• bei Durchführung chemischer Analysen: Angabe der verwendeten Methoden und der Ergebnisse;
• ggf. Ergebnisse des Limit-Tests;
• Gründe für die Auswahl und Einzelheiten der Durchführung der Prüfung (z.B. statisch, semistatisch, Dosierungsrate, Durchflußrate, ob belüftet, Fischbesatz usw.);
• Beschreibung der Prüfgeräte;
• Beleuchtungsverhältnisse;
• Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs, pH-Werte, Temperaturen in den Prüflösungen alle 24 Stunden;
• Nachweis, daß die Qualitätskriterien erfüllt sind;
• Tabelle der kumulativen Mortalität bei jeder Konzentration und bei der Kontrolle (ggf. auch bei der Kontrolle mit dem Hilfsstoff) zu den empfohlenen Beobachtungszeitpunkten;
• graphische Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve am Ende der Prüfung;
• wenn möglich, die LC₅₀-Werte für jeden empfohlenen Beobachtungszeitpunkt (möglichst mit 95 % Vertrauensbereich);
• verwendete statistische Verfahren zur Bestimmung der LC₅₀-Werte;
• bei Verwendung einer Referenzsubstanz Angabe der Ergebnisse;
• höchste eingesetzte Prüfkonzentrationen ohne Mortalität im Prüfzeitraum;
• niedrigste eingesetzte Prüfkonzentration mit 100 % Mortalität im Prüfzeitraum.

C.1. 4. Literatur

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C (81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.

(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.

(4) ISO 7364/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Commitee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities,Inter-Laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. OEkotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Lichtfield, J, T. and Wilcoxon, F., a simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Phare, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17) Spragü, J. B. Measurement of pullutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC₅₀. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelinck). American Society for Testing and Materials. ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. a computer program for calculating an LC₅₀. US EPA.

Anlage 1
zu RL 67/548/EWG Anhang V C.1.

Zubereitetes Wasser

Beispiel für ein geeignetes Verdünnungswasser Alle Chemikalien müssen analysenrein sein.

Das Wasser muß einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer Leitfähigkeit von weniger als 5 µScm^-1 sein.

Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile enthalten.

Stammlösungen

Zubereitetes Verdünnungswasser

Je 25 ml der vier Stammlösungen mischen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

Solange belüften, bis die Konzentration an gelöstem Sauerstoff dem Luftsauerstoff-Sättigungswert entspricht.

Der pH-Wert muß 7,8 ± 0,2 betragen.

Falls erforderlich, ist der pH-Wert mit NaOH (Natronlauge) oder HCl (Salzsäure) einzustellen.

Dieses Verdünnungswasser läßt man 12 Stunden stehen; eine weitere Belüftung ist nicht erforderlich.

Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol/l. Das Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4:1 und das der Na- zu den K-Ionen 10:1. Die Gesamtalkalinität dieser Lösung liegt bei 0,8 mmol/l.

Eine abweichende Zubereitung des Verdünnungswassers darf die Zusammensetzung oder die Eigenschaften des Wassers nicht verändern.

Anlage 2
zu RL 67/548/EWG Anhang V C.1.

Beschaffung

Die oben aufgeführten Fischarten lassen sich leicht züchten und/oder sind das ganze Jahr über weitgehend verfügbar. Sie lassen sich in Fischzuchtbetrieben oder in Prüfeinrichtungen unter Bedingungen züchten und aufziehen, die eine Kontrolle über Krankheiten und Parasiten erlauben, so daß sie für eine Prüfung gesund und von bekannter Herkunft sind. Diese Fischarten sind in vielen Teilen der Welt erhältlich.

Anlage 3 .
zur RL 67/548/EWG Anhang V C.1.

Beispiel für eine Konzentrations-Mortalitätskurve

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