zurück

zur aktuellen Fassung

C.2. 1. Methode

C.2. 1.1. Einleitung

Mit diesem Test soll die mittlere effektive (Wirk-)Konzentration (EC₅₀) einer Substanz zur Erzeugung von Schwimmunfähigkeit bei Daphnien in Süßwasser bestimmt werden. Soweit wie möglich sollten Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubarkeit der Prüfsubstanz vor dem Beginn der Prüfung vorhanden sein.

Weitere Angaben (z.B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Prozentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und Menge von Zusätzen sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.

C.2. 1.2. Definitionen und Einheiten

Die Forderung der Richtlinie nach Ermittlung der LC₅₀ bei Daphnien gilt durch Bestimmung der EC₅₀, wie sie in dieser Prüfmethode beschrieben wird, als erfüllt.

Im Sinne dieser Prüfmethode wird die akute Toxizität als die mittlere effektive (Wirk-)Konzentration (EC₅₀) zur Erzeugung der Schwimmunfähigkeit verstanden. Dies ist die Konzentration, bezogen auf die Ausgangskonzentration, die 50 % der Daphnien einer Prüfgruppe innerhalb eines genau anzugebenden kontinuierlichen Einwirkungszeitraums (Expositionszeitraums) schwimmunfähig macht.

Schwimmunfähigkeit:

Es gelten diejenigen Daphnien als schwimmunfähig, die nach leichter Bewegung des Prüfbehälters innerhalb von 15 Sekunden keine Schwimmbewegungen zeigen.

Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen (mg/l) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg/kg ) angegeben werden.

C.2. 1.3. Referenzsubstanzen

Eine Referenzsubstanz kann getestet werden, um nachzuweisen, daß sich die Reaktion der geprüften Art unter den Bedingungen der Prüfeinrichtung nicht wesentlich geändert hat. Die Ergebnisse eines EWG-Ring-Tests unter Verwendung von vier verschiedenen Substanzen sind in Anlage 2 zusammengefaßt.

C.2. 1.4. Prinzip der Methode

Es kann ein Limit-Test mit 100 mg/l durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC₅₀ über dieser Konzentration liegt.

Die Daphnien werden der dem Wasser in verschiedenen Konzentrationen zugesetzten Prüfsubstanz für 48 Stunden ausgesetzt. Wird ein kürzerer Prüfzeitraum verwendet, ist dies im Prüfbericht zu begründen.

Unter sonst gleichen Prüfbedingungen und bei einem angemessenen Bereich von Prüfkonzentrationen wirken sich verschiedene Konzentrationen einer Prüfsubstanz unterschiedlich auf die Schwimmfähigkeit der Daphnien aus. Bei verschiedenen Konzentrationen ergeben sich dann nach Ablauf der Prüfzeit jeweils bestimmte prozentuale Anteile schwimmunfähiger Daphnien. Diejenigen Konzentrationen, die 0 % bzw. 100 % Schwimmunfähigkeit verursachen, werden direkt aus den Prüfbeobachtungen erhalten, während der 48-Stunden-EC₅₀-Wert, soweit möglich, durch Berechnung ermittelt wird.

Bei dieser Methode wird ein statisches Verfahren angewendet. Die Prüflösungen werden daher während des Expositionszeitraums nicht erneuert.

C.2. 1.5. Qualitätskriterien

Die Qualitätskriterien gelten sowohl für den Limit-Test als auch für das vollständige Prüfverfahren.

Bei den Kontrollen dürfen bei Versuchsende höchstens 10 % der Daphnien schwimmunfähig sein.

Die Daphnien der Kontrollgruppen dürfen nicht an der Wasseroberfläche hängenbleiben.

Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den Prüfgefäßen sollte während des gesamten Prüfzeitraums über 3 mg/l betragen. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs darf jedoch auf keinen Fall unter 2 mg/l absinken.

Die Konzentration der Prüfsubstanz soll über den gesamten Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentration gehalten werden.

Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem Masse verflüchtigen oder nicht in einem solchen Masse abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es ist nachzuweisen, daß die Konzentrationen über den gesamten Prüfzeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfüllt worden sind.

Bei Substanzen, die

1. im Prüfmedium schwer löslich sind oder
2. stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder
3. in wäßrigen Lösungen nicht stabil sind,

soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei Prüfbeginn in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen worden ist. Die Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung, jedoch vor Einbringen der Prüforganismen bestimmt werden.

In all diesen Fällen müssen im Verlauf der Prüfung weitere Messungen durchgeführt werden, um zu bestätigen, daß die Expositionskonzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfüllt worden sind.

Der pH-Wert soll nicht um mehr als eine Einheit schwanken.

C.2. 1.6. Beschreibung der Methode

C.2. 1.6.1. Reagenzien

C.2. 1.6.1.1. Lösungen der Prüfsubstanzen

Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser entsprechend 1.6.1.2. hergestellt.

Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Verdünnung des Stammansatzes zubereitet. Werden hohe Konzentrationen geprüft, kann die Prüfsubstanz unmittelbar im Verdünnungswasser gelöst werden.

Die Substanzen sollten im allgemeinen nur bis zur Löslichkeitsgrenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z.B. bei solchen mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem Pow oder solchen, die im Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt. Somit ist sichergestellt, daß die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, daß diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z.B. durch Bildung eines Substanzfilms auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).

Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche Menge des Hilfsstoffes enthalten und müssen zusätzliche Kontroll-Fische derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration derartiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall jedoch 100 mg/l im Prüfmedium überschreiten.

Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wiederholen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Verdünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muß so erfolgen, daß sich die Konzentration der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physikalische Ausfällung des Prüfsubstanz ergeben, so muß diese Beobachtung im Prüfbericht protokolliert werden.

C.2. 1.6.1.2. Prüfwasser

Für diese Prüfung ist zubereitetes Wasser zu verwenden (siehe Anlage 1 und Literaturstelle 2: ISO 6341). Um die Notwendigkeit einer Anpassung an die Prüfbedingungen zu vermeiden, wird empfohlen, für die Kultur Wasser ähnlicher Qualität (z.B. pH-Wert, Härte) wie für die Prüfung zu verwenden.

C.2. 1.6.2. Geräte

Es sind die üblichen Geräte und Ausstattungen von Prüfeinrichtungen zu verwenden. Teile, die mit den Prüflösungen in Berührung kommen, sollten vorzugsweise aus Glas bestehen:

• Sauerstoffmeßgerät (mit Mikroelektrode oder einem anderen geeigneten Gerät zur Messung von gelöstem Sauerstoff in kleinen Proben);
• geeignetes Gerät zur Temperaturmessung;
• pH-Meßgerät;
• Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte.

C.2. 1.6.3. Prüforganismen

Daphnia magna ist die bevorzugte Art, obwohl auch Daphnia pulex verwendet werden kann. Die Versuchstiere sollen zu Beginn der Prüfung weniger als 24 Stunden alt, in der Prüfeinrichtung gezüchtet, frei von offensichtlichen Krankheiten und von bekannter Herkunft (z.B. Aufzucht, Vorbehandlungen usw.) sein.

C.2. 1.6.4. Durchführung der Prüfung

Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorangehen. Dieser Vorversuch liefert Informationen über den in der eigentlichen Prüfung zu verwendenden Konzentrationsbereich.

Zusätzlich zu den Konzentrationen der Prüfsubstanz sind eine Kontrolle ohne die Prüfsubstanz und ggf. eine Kontrolle mit dem Hilfsstoff einzusetzen.

Die Daphnien werden der Prüfsubstanz wie im folgenden beschrieben ausgesetzt:

• Dauer: vorzugsweise 48 Stunden,
• Anzahl der Tiere: mindestens 20 je Konzentration, vorzugsweise aufgeteilt in 4 Gruppen von je 5 Daphnien oder 2 Gruppen von je 10 Daphnien,
• Besatz: Je Daphnie mindestens 2 ml Testlösung,
• Prüfkonzentration: Die Prüflösung ist unmittelbar vor dem Einsetzen der Daphnien zuzubereiten, möglichst nur mit Wasser als einzigem Lösungsmittel. Die Konzentrationen werden in geometrischer Reihe mit einem Faktor angesetzt, der 2,2 nicht überschreiten darf. Zusammen mit den Kontrollen sind Konzentrationen einzusetzen, die ausreichen, um nach 48 Stunden 0 % und 100 % Schwimmunfähigkeit hervorzurufen, sowie ein Bereich von dazwischenliegenden Konzentrationen, die die Berechnung des 48-Stunden-EC₅₀-Wertes erlauben,
• Wasser: siehe 1.6.1.2.,
• Beleuchtung: ein Hell-Dunkel-Zyklus ist erwünscht,
• Temperatur: Die Temperatur muß zwischen 18 °C und 22 °C liegen. Für jede einzelne Prüfung hat sie jedoch innerhalb von ± 1 °C konstant zu bleiben,
• Belüftung: Die Prüflösungen sollen nur leicht belüftet werden,
• Fütterung: keine.

Am Ende der Prüfung sind der pH-Wert und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff in den Kontrollen und in jeder Prüfkonzentration zu bestimmen. Der pH-Wert der Prüflösungen darf nicht verändert werden.

Flüchtige Verbindungen sind in randvoll gefüllten, geschlossenen Behältern zu untersuchen, die groß genug sind, um Sauerstoffmangel zu vermeiden.

Die Daphnien werden mindestens nach 24 Stunden und erneut nach 48 Stunden Expositionszeit untersucht.

Limit-Test

Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Methoden kann ein Limit-Test mit 100 mg/l durchgeführt werden, um nachzuweisen, daß die EC₅₀ über dieser Konzentration liegt.

Wenn die Substanz so beschaffen ist, daß eine Konzentration von 100 mg/l im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit-Test bei einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Dispersion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch Punkt 1.6.1.1.).

Der Limit-Test ist mit 20 Daphnien, die in zwei oder vier Gruppen unterteilt werden, und der gleichen Anzahl Kontrollen durchzuführen. Wenn Schwimmunfähigkeit eintritt, ist das vollständige Prüfverfahren anzuwenden.

C.2. 2. Daten und Auswertung

Die Mortalität wird für jeden Zeitraum, in dem Beobachtungen protokolliert wurden (24 und 48 Stunden), auf Wahrscheinlichkeitspapier (mit logarithmischer Einteilung) gegen die Konzentration aufgetragen.

Soweit möglich, sollten die EC₅₀ und der jeweilige Vertrauensbereich (p = 0,05) für jeden Beobachtungszeitraum nach Standardverfahren ermittelt werden. Diese Werte sind auf eine oder höchstens zwei signifikante Stelle(n) zu runden (Beispiele für das Runden auf zwei Stellen: 170 für 173,5; 0,13 für 0,127; 1,2 für 1,21).

Sollte der Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für eine Berechnung der EC₅₀ zu steil sein, so reicht eine graphische Abschätzung dieses Wertes.

Ergeben zwei unmittelbar aufeinanderfolgende Konzentrationen, die sich durch den Faktor 2,2 unterscheiden, nur 0 % und 100 % Mortalität, so werden diese beiden Werte zur Angabe des Bereichs, in den die EC₅₀ fällt, herangezogen.

Wird beobachtet, daß die Stabilität oder Homogenität der Prüfsubstanz nicht aufrechterhalten werden kann, so ist dies im Prüfbericht mitzuteilen und bei der Interpretation der Ergebnisse entsprechend zu berücksichtigen.

C.2. 3. Abschlußbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• Angaben über die verwendeten Organismen (wissenschaftlicher Name, Stamm, Züchter oder Bezugsquelle, Vorbehandlungen, Aufzuchtverfahren - einschließlich Herkunft, Art und Menge der Nahrung, Häufigkeit der Fütterung);
• Herkunft des Verdünnungswassers und wichtige chemische Eigenschaften (pH-Wert, Härte, Temperatur);
• Bei Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit: Angabe der Methode zur Herstellung des Stammansatzes und der Prüflösungen;
• Konzentration aller Hilfsstoffe;
• Liste der verwendeten Konzentrationen sowie alle vorhandenen Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz in der Prüflösung bei den verwendeten Konzentrationen;
• bei Durchführung chemischer Analysen: Angabe der verwendeten Methoden und der Ergebnisse;
• ggf. Ergebnisse des Limit-Tests;
• Beschreibung der Prüfgeräte;
• Beleuchtungsverhältnisse;
• Konzentration des gelösten Sauerstoffs, pH-Werte, Temperatur der Prüflösungen;
• Nachweis, daß die Qualitätskriterien erfüllt sind;
• Tabelle der kumulativen Mortalität bei jeder Konzentration und bei der Kontrolle (ggf. auch bei der Kontrolle mit dem Hilfsstoff) zu den empfohlenen Beobachtungszeitpunkten (24 und 48 Stunden);
• graphische Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve am Ende der Prüfung;
• wenn möglich, die EC₅₀-Werte für jeden empfohlenen Beobachtungszeitpunkt (möglichst mit 95 % Vertrauensbereich);
• verwendete statistische Verfahren zur Bestimmung der EC₅₀-Werte;
• bei Verwendung einer Referenzsubstanz Angabe der Ergebnisse;
• höchste eingesetzte Prüfkonzentrationen ohne Mortalität im Prüfzeitraum;
• niedrigste eingesetzte Prüfkonzentration mit 100 % Mortalität im Prüfzeitraum.

C.2. 4. Literatur

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudoplh, P. und Boje, R. OEkotoxikologie, Grundlagen fur die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K.

(7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. a simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC₅₀. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stepahn, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. a computer program for calculating an LC₅₀. US EPA.

Anlage 1
zur RL 67/548/EWG Anhang V C.2.

Zubereitetes Wasser

Beispiel für ein geeignetes Verdünnungswasser (nach ISO 6341)

Alle Chemikalien müssen analysenrein sein.

Das Wasser muß einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer Leitfähigkeit von weniger als 5 µScm^-1 sein.

Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile enthalten.

Stammlösungen

Zubereitetes Verdünnungswasser

Je 25 ml der vier Stammlösungen mischen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen.

Solange belüften, bis die Konzentration an gelöstem Sauerstoff dem Luftsauerstoff-Sättigungswert entspricht.

Der pH-Wert muß 7,8 ± 0,2 betragen.

Falls erforderlich, ist der pH-Wert mit NaOH (Natriumhydroxid) oder HCl (Salzsäure) einzustellen.

Dieses Verdünnungswasser läßt man 12 Stunden stehen; eine weitere Belüftung ist nicht erforderlich.

Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol/l. Das Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4 : 1 und das der Na- zu den K-Ionen 10 : 1. Die Gesamtalkalinität dieser Lösung liegt bei 0,8 mmol/l.

Eine abweichende Zubereitung des Verdünnungswassers darf die Zusammensetzung oder die Eigenschaften des Wassers nicht verändern.

Anlage 2
zur RL 67/548/EWG Anhang V C.2.

Zusammenfassung der Ergebnisse eines EWG-Ring-Tests, durchgeführt im Jahre 1978 (vgl. auch (2))

Achtung: Ziel dieses Ring-Tests war die Bestimmung der 24-Stunden-EC₅₀.

Verwendete Substanzen:

1. Kaliumdichromat
2. Tetrapropylbenzolsulfonsäure
3. Tetrapropylbenzolsulfonsäure, Natriumsalz
4. Trichlor-2,4,5-phenoxy-Essigsäure, Kaliumsalz

Anlage 3
zur RL 67/548/EWG Anhang V C.2.

weiter .