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C.19. 1. Methode

Diese Methode entspricht der OECD TG121 (2000).

C.19 .1.1. Einleitung

Das Sorptionsverhalten von Stoffen in Böden oder Klärschlämmen kann anhand von Parametern beschrieben werden, die experimentell mittels der Testmethode C.18 bestimmt werden. Ein wichtiger Parameter ist der Adsorptionskoeffizient, der als das Verhältnis zwischen der Konzentration des Stoffs im Boden/Klärschlamm und der Konzentration des Stoffs in der wässrigen Phase im Adsorptionsgleichgewicht definiert wird. Der aufgrund des Gehalts des Bodens an organischem Kohlenstoff genormte Adsorptionskoeffizient, K_oc, ist ein nützlicher Indikator für die Fähigkeit eines chemischen Stoffs zur Bindung an organischen Stoff im Boden oder Klärschlamm und gestattet Vergleiche zwischen unterschiedlichen Chemikalien. Dieser Parameter kann durch Korrelation mit der Wasserlöslichkeit und dem Verteilungskoeffizienten n-Octanol/Wasser geschätzt werden (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

Die in diesem Test beschriebene Versuchsmethode wendet für die Schätzung des Adsorptionskoeffizienten K_oc im Boden und in Klärschlamm die HPLC an (8). Die Schätzwerte sind verläßlicher als die der QSAR-Berechnungen (9). Als Schätzmethode kann sie die in der Test-Methode C.18 verwendeten Batch equilibrium-Experimente nicht vollständig ersetzen. Jedoch kann der geschätzte K_oc für die Auswahl geeigneter Testparameter für Adsorptions-/Desorptionsstudien gemäß der Testmethode C18 durch Berechnung von K_d (Verteilungskoeffizient) oder K_f (Adsorptionskoeffizient nach Freundlich) nach der Gleichung 3 (siehe Abschnitt 1.2) nützlich sein.

C.19. 1.2. Definitionen

K_d : Der Verteilungskoeffizient Feststoff/Wasser wird als das Verhältnis der Gleichgewichtskonzentrationen C einer gelösten Testsubstanz in einem zweiphasigen System, das aus einem Sorptionsmittel (Boden oder Klärschlamm) und einer wässrigen Phase besteht, definiert; er ist eine reine Zahl, wenn Konzentrationen in beiden Phasen in Gewicht/Gewicht ausgedrückt sind. Wird die Konzentration in der wässrigen Phase in Gewicht/Volumen ausgedrückt, sind die Einheiten ml·g^-1. K_d kann je nach den Eigenschaften des Sorptionsmittels unterschiedlich und auch konzentrationsabhängig sein.

dabei ist:

K_f: Der Adsorptionskoeffizient nach Freundlich wird definiert als die Konzentration der Testsubstanz im Boden oder im Klärschlamm (x/m), wenn die Gleichgewichtskonzentration C_aq in der wässrigen Phase gleich eins ist; er wird in µg × g^-1 Sorptionsmittel ausgedrückt. Sein Wert kann je nach den Eigenschaften des Sorptionsmittels unterschiedlich sein.

log x/m = log K_f + 1/n × log C_aq              (2)

dabei ist:

Bei C_aq = 1; log K_f = log x/m

K_oc: ist der aufgrund des organischen Kohlenstoffgehalts (f_oc ) eines Sorptionsmittels genormte Verteilungskoeffizient (K_d ) oder Adsorptionskoffizient nach Freundlich (K_f ); dieser Koeffizient ist insbesondere für nicht ionisierte Chemikalien ein ziemlich genauer Indikator für den Grad der Adsorption eines Stoffes an das Sorptionsmittel und ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Chemikalien. Je nach den Meßgrößen von K_d und K_f kann K_oc eine reine Zahl sein oder in ml × g^-1 oder µg × g^-1 organische Stoffe ausgedrückt werden.

K_oc = K_d/f_oc (dimensionlos oder ml × g^-1) oder K_f/f_oc (µg × g^-1)            ( 3)

Das Verhältnis zwischen K_oc und K_d ist nicht immer linear, daher können K_oc -Werte auch je nach Bodentyp variieren, doch ist ihre Variabilität im Vergleich zu den K_d - oder K_f -Werten viel geringer.

Der Adsorptionskoeffizient (K_oc ) wird von dem Kapazitätsfaktor (kx) mittels einer Eichkurve log kx/log K_oc der ausgewählten Referenzverbindungen hergeleitet.

dabei ist:

t_R : HPLC-Retentionszeit der Test- und Referenzsubstanz (Minuten)

t₀ : HPLC-Totzeit (Minuten) (siehe Abschnitt 1.8.2).

P_OW: Der Verteilungskoeffizient Octanol/Wasser wird definiert als das Verhältnis der Konzentrationen gelöster Stoffe in n-Octanol und Wasser; er ist eine reine Zahl.

C.19. 1.3. Referenzsubstanzen

Die Strukturformel, die Reinheit und die Dissoziationskonstante (sofern zutreffend) sollten vor Anwendung der Methode bekannt sein. Informationen über die Löslichkeit in Wasser und organischen Lösemitteln, über den Trennungskoeffizienten Octanol/Wasser und über Hydrolyse-Merkmale sind nützlich.

Um die gemessenen HPLC-Retentionsdaten einer Testsubstanz mit ihrem Adsorptionskoeffizienten K_oc zu korrelieren, muß eine Eichkurve log K_oc /log kx erstellt werden. Mindestens sechs Referenzpunkte sollten verwendet werden, davon zumindest einer über und einer unter dem erwarteten Wert der Testsubstanz. Die Genauigkeit der Methode wird erheblich verbessert, wenn Referenzsubstanzen verwendet werden, die von der Struktur her mit der Testsubstanz verwandt sind. Liegen derartige Daten nicht vor, muß der Anwender die geeigneten Eichsubstanzen selbst auswählen. In diesem Fall sollte eine allgemeinere Reihe von strukturell heterogenen Stoffen gewählt werden. Empfohlene Referenzsubstanzen und ihre K_oc -Werte sind in den Tabellen 1 und 3 des Anhangs aufgelistet. Die Wahl anderer Eichsubstanzen ist zu begründen.

C.19. 1.4. Prinzip der Testmethode

Die HPLC wird auf Analysesäulen durchgeführt, die mit im Handel erhältlicher Cyanopropyl-Festphase mit lipophilen und polaren Anteilen gefüllt sind. Ferner wird eine gemäßigt polare stationäre Phase auf der Grundlage einer Silica-Matrix verwendet:

Das Prinzip der Testmethode ist ähnlich wie bei der Testmethode A.8 (Verteilungskoeffizient, HPLC-Methode).

Während die Testsubstanz die Säule mit der mobilen Phase passiert, steht die Testsubstanz zu der stationären Phase in einer Wechselwirkung. Durch die Trennung zwischen der mobilen und der stationären Phase wird die Testsubstanz verzögert. Die Ambivalenz der stationären Phase mit polaren und nicht polaren Verbindungsstellen ermöglicht eine ähnliche Wechselwirkung zwischen polaren und nicht polaren Gruppen eines Moleküls wie bei organischen Stoffen in Boden- oder Klärschlamm-Matrizen. Dies ermöglicht die Feststellung des Verhältnisses zwischen der Retentionszeit auf der Säule und dem Koeffizienten der Adsorption durch organischen Stoff.

Der pH-Wert hat insbesondere bei polaren Substanzen einen signifikanten Einfluß auf das Sorptionsverhalten.

Bei landwirtschaftlichen Böden oder Behältern von Klärschlammbehandlungsanlagen schwankt der pH-Wert normalerweise zwischen 5,5 und 7,5. Für ionisierbare Stoffe sind zwei Tests mit sowohl ionisierten als auch nicht ionisierten Formen in geeigneten Pufferlösungen durchzuführen, jedoch nur in Fällen, in denen zumindest 10 % der Testverbindung bei pH-Werten zwischen 5,5 und 7,5 dissoziiert vorliegen.

Da die Bewertung ausschließlich aufgrund der Relation zwischen der Retention in der HPLC-Säule und dem Adsorptionskoeffizienten erfolgt, ist keine quantitative Analysemethode, sondern nur eine Bestimmung der Retentionszeit erforderlich. Sofern eine Reihe geeigneter Referenzsubstanzen zur Verfügung stehen und die Versuche unter Standardbedingungen durchgeführt werden können, bietet die Methode einen schnellen und wirksamen Weg zur Schätzung des Adsorptionskoeffizienten K_oc .

C.19. 1.5. Anwendbarkeit des Tests

Die HPLC-Methode ist auf (markierte oder nicht markierte) Chemikalien anwendbar, für die ein geeignetes Detektionssystem (z.B. Spektrophotometer, Radioaktivitätsanzeiger) zur Verfügung steht und die für die Dauer des Tests stabil genug sind. Die Methode kann insbesondere für Chemikalien brauchbar sein, deren Untersuchung in anderen Versuchssystemen schwierig ist (d. h. flüchtige Stoffe; Stoffe, die in Wasser in einer analytisch messbaren Konzentration nicht löslich sind; Stoffe mit einer starken Affinität gegenüber der Oberfläche von Inkubationssystemen). Die Methode kann auf Mischungen angewendet werden, die nicht aufgelöste Elutionsbänder ergeben. In einem solchen Fall sind die Ober- und Untergrenzen der log K_oc -Werte der Verbindungen der Testmischung anzugeben.

Zwar können Unreinheiten zuweilen zu Problemen bei der Interpretation der HPLC-Ergebnisse führen, doch sind sie von geringerer Bedeutung, solange die Testsubstanz auf analytischem Wege identifiziert und von den Unreinheiten getrennt werden kann.

Die Methode ist mit den in Tabelle 1 des Anhangs aufgelisteten Stoffen validiert worden und wurde auch auf verschiedene andere Chemikalien angewandt, die zu den folgenden Chemikalienklassen gehören:

• aromatische Carbonsäureester (z.B. Benzoesäuremethylester, 3,5-Dinitrobenzoesäureethylester);
• aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Toluol, Xylol, Ethylbenzol, Nitrobenzol);
• aromatic hydrocarbons (e.g. toluene, xylene, ethylbenzene, nitrobenzene),
• Aryloxyphenoxypropionsäureester (z.B. Diclofop-methyl, Fenoxaprop-ethyl, Fenoxaprop-P-ethyl);
• Benzimidazol- und Imidazol-Fungizide (z.B. Carbendazim, Fuberidazol, Triazoxid);
• Carbonsäureamide (z.B. 2-Chlorbenzamid, N,N-Dimethylbenzamid, 3,5-Dinitrobenzamid, N-Methylbenzamid, 2-Nitrobenzamid, 3-Nitrobenzamid);
• Chlorkohlenwasserstoffe (z.B. Endosulfan, DDT, Hexachlorbenzol, Quintozen, 1,2,3-Trichlorbenzol);
• phosphororganische Insektizide (z.. B. Azinphos-methyl, Disulfoton, Fenamiphos, Isofenphos, Pyrazophos, Sulprofos, Triazophos);
• Phenole (z.B. Phenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentachlorphenol, 2,4,6-Trichlorphenol, 1-Naphthol);
• Phenylharnstoffderivative (z.B. Isoproturon, Monolinuron, Pencycuron);
• Pigmentfarbstoffe (z.B. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81);
• polyaromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Acenaphthen, Naphthalin);
• 1,3,5-Triazin-Herbizide (z.B. Prometryn, Propazin, Simazin, Terbutryn);
• Triazolderivate (z.B. Tebuconazol, Triadimefon, Tradimenol, Triapenthenol).

Die Methode ist nicht auf Stoffe anwendbar, die entweder mit dem Eluenten oder der stationären Phase reagieren. Ferner ist sie nicht auf Stoffe anwendbar, die in einer spezifischen Wechselwirkung mit anorganischen Verbindungen stehen (z.B. Bildung von Clusterkomplexen mit Tonmineralien). Es ist möglich, dass sich die Methode nicht für oberflächenaktive Stoffe, anorganische Verbindungen und gemäßigt oder stark organische Säuren und basen eignet. Log K_oc -Werte im Bereich 1,5 bis 5,0 können bestimmt werden. Ionisierbare Stoffe müssen mittels einer gepufferten mobilen Phase gemessen werden, doch ist darauf zu achten, dass eine Präzipitation von Pufferkomponenten oder der Testsubstanz vermieden wird.

C.19 .1.6. Qualitätskriterien

C.19. 1.6.1. Genauigkeit

Normalerweise kann der Adsorptionskoeffizient einer Testsubstanz auf +/ -0,5 log. Einheiten des Werts geschätzt werden, der nach der Batch equilibrium-Methode (siehe Tabelle 1 des Anhangs) bestimmt wird.

Größere Genauigkeit kann erzielt werden, wenn die verwendeten Referenzsubstanzen von der Struktur her mit der Testsubstanz verwandt sind.

C.19. 1.6.2. Wiederholbarkeit

Die Bestimmungen müssen mindestens doppelt durchgeführt werden. Die von Einzelmessungen hergeleiteten log K_oc -Werte müssen innerhalb von 0,25 log. Einheiten liegen.

C.19. 1.6.3. Reproduzierbarkeit

Die bisher mit der Methode gewonnenen Erfahrungen sprechen für ihre Validität. Eine Prüfung der HPLC-Methode, bei der 48 Stoffe (zumeist Pestizide) verwendet wurden, für die verlässliche Daten über K_oc in Böden vorlagen, ergab einen Korrelationskoeffizienten von = 0,95 (10) (11).

Ein Ringversuch mit 11 teilnehmenden Laboratorien wurde durchgeführt, um die Methode zu verbessern und zu validieren (12). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 des Anhangs enthalte.

C.19. 1.7. Beschreibung der Testmethode

C.19. 1.7.1. Vorbereitende Schätzung des Adsorptionskoeffizienten

Der Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient P_ow (= K_ow ) und in bestimmtem Maße die Wasserlöslichkeit können als Indikatoren für den Adsorptionsgrad, insbesondere für nicht ionisierte Stoffe, dienen und können somit zur Bereichsfindung verwendet werden. Für verschiedene Gruppen von Chemikalien wurden eine Reihe nützlicher Korrelationen veröffentlicht (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

C.19. 1.7.2. Geräte

Erforderlich ist ein Flüssig-Chromatograph, der mit einer impulsfreien Pumpe und einem geeigneten Detektor ausgerüstet ist. Es wird empfohlen, ein Injektionsventil mit einer Injektionsschleife zu verwenden. Ferner ist ein im Handel erhältliches chemisch gebundenes Cyanpropylharz auf Silica-Basis (z.B. Hypersil und Zorbax CN) zu verwenden. Eine Vorsäule mit demselben Material kann zwischen dem Injektionssystem und der Analysesäule plaziert werden. Säulen unterschiedlicher Lieferanten können hinsichtlich der Trennwirkung sehr unterschiedlich sein. Als Richtschnur müssen folgende Kapazitätsfaktoren k¡ erzielt werden: log kx > 0,0 für log K_oc = 3,0 und log kx > 0,4 für log K_oc = 2,0 bei Verwendung von Methanol/Wasser 55/45 % als mobile Phase.

C.19. 1.7.3. Mobile Phasen

Von den verschiedenen mobilen Phasen, die getestet wurden, werden folgende zwei empfohlen:

• Methanol/Wasser (55/45 % v/v)
• Methanol/0,01M Citratpuffer pH 6,0 (55/45 % v/v)

Zur Herstellung der Eluierflüssigkeit sind Methanol von HPLC-Qualität und destilliertes Wasser oder Citratpuffer zu verwenden. Das Gemisch wird vor der Verwendung entgast. Es empfiehlt sich, eine isokratische Elution anzuwenden. Wenn das Methanol/Wasser-Gemisch nicht geeignet ist, können andere Gemische aus organischen Lösemitteln und Wasser, z.B. Ethanol/Wasser- oder Acetonitril/Wasser-Gemische versucht werden. Für ionisierende Verbindungen wird die Verwendung einer Pufferlösung zur pH-Stabilisierung empfohlen. Es ist darauf zu achten, dass Salzniederschlag/Salzpräzipitation und eine Säulenverschlechterung vermieden werden, die bei einigen organische Phase/Puffer-Gemischen auftreten können.

Es dürfen keine Zusätze wie Ionenpaar-Reagenzien verwendet werden, weil sie die Sorptionseigenschaften der stationären Phase beeinträchtigen können. Derartige Veränderungen der stationären Phase können irreversibel sein. Aus diesem Grunde ist es unbedingt erforderlich, dass Versuche, bei denen Zusätze verwendet werden, an getrennten Säulen durchgeführt werden.

C.19. 1.7.4. Gelöste Stoffe

Test- und Referenzsubstanzen sollten in der mobilen Phase gelöst werden.

C.19. 1.8. Durchführung des Tests

C.19. 1.8.1. Testbedingungen

Die Temperatur während der Messungen ist aufzuzeichnen. Für das Säulenkompartiment wird eine Temperaturregelung sehr empfohlen, um konstante Bedingungen während der Eichung und Schätzung sowie der Messung der Testsubstanz zu gewährleisten.

C.19. 1.8.2. Bestimmung der Totzeit t_o

Für die Bestimmung der Totzeit t_o können zwei unterschiedliche Methoden angewendet werden (siehe auch Abschnitt 1.2).

C.19. 1.8.2.1. Bestimmung der Totzeit t_o durch eine homologe Reihe

Es hat sich herausgestellt, dass dieses Verfahren verlässliche und standardisierte to -Werte ergibt. Für weitere Einzelheiten siehe Testmethode A.8: Verteilungskoeffizient (n-Octanol/Wasser), HPLC-Methode.

C.19. 1.8.2.2. Bestimmung der Totzeit t_o durch inerte Stoffe, bei denen keine Retention durch die Säule auftritt

Diese Technik basiert auf der Injektion von Formamid-, Harnstoff- oder Natriumnitratlösungen. Die Messungen sollten zumindest doppelt ausgeführt werden.

C.19. 1.8.3. Bestimmung der Retentionszeiten t_R

Referenzsubstanzen sind gemäß der Beschreibung in Abschnitt 1.3 auszuwählen. Sie können zur Bestimmung ihrer Retentionszeiten als gemischter Standard injiziert werden, sofern bestätigt worden ist, dass die Retentionszeiten der einzelnen Referenzstandards nicht durch das Vorhandensein der anderen Referenzstandards beeinflusst werden. Die Eichung muß in regelmäßigen Abständen mindestens zweimal täglich erfolgen, um unerwarteten Veränderungen in der Leistung der Säule Rechnung zu tragen. Die Injektionen sind vorzugsweise vor und nach den Injektionen der Testsubstanz durchzuführen, um sicher zu sein, dass die Retentionszeiten unverändert sind. Die Testsubstanzen werden getrennt in möglichst kleinen Dosen injiziert (um ein Überladen der Säule zu vermeiden), dann werden ihre Retentionszeiten bestimmt.

Um die Verlässlichkeit der Messung zu erhöhen, sind sie zumindest doppelt durchzuführen. Die von Einzelmessungen hergeleiteten log K_oc -Werte müssen im Bereich von 0,25 log. Einheiten liegen.

C.19. 1.8.4. Bewertung

Die Kapazitätsfaktoren kx werden aus der Totzeit t_o und den Retentionszeiten t_R der gewählten Testsubstanzen nach der Formel 4 (siehe Abschnitt 1.2) berechnet. Die log kx-Daten der Referenzsubstanzen werden daraufhin gegen ihre in den Tabellen 1 und 3 des Anhangs genannten log K_oc -Werte aus den Batch equilibrium-Experimenten aufgetragen. Mit Hilfe dieser Kurve wird der log kx-Wert einer Testsubstanz zur Bestimmung ihres log K_oc -Wertes verwendet. Wenn die tatsächlichen Werte zeigen, dass der log K_oc der Testsubstanz außerhalb des Eichbereichs liegt, ist der Test unter Verwendung anderer geeigneterer Referenzsubstanzen zu wiederholen.

C.19. 2. Daten und Berichterstattung

Der Bericht muss folgende Informationen enthalten:

• Identität, Reinheit und gegebenenfalls pK_a -Werte von Test- und Referenzsubstanzen;
• Beschreibung der Apparatur und der Betriebsbedingungen, z.B. Typ und Abmessung der Analysesäule (sowie Vorsäule), Detektionsvorrichtung, mobile Phase (Verhältnis zwischen Bestandteilen und pH-Wert), Temperaturbereich während der Messungen;
• Totzeit und die für ihre Bestimmung angewandte Methode;
• Mengen der in die Säule eingebrachten Test- und Referenzsubstanzen;
• Retentionszeiten der für die Eichung verwendeten Referenzverbindungen;
• Einzelheiten der angepaßten Regressionslinie (log kx/log K_oc ) und grafische Darstellung der Regressionslinie;
• durchschnittliche Retentionsdaten und geschätzter log K_oc -Wert der Testverbindung;
• Chromatogramme.

C.19. 3. Literaturhinweise

(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.

(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.

(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.

(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 297-312.

(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). a physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, pp. 831-832.

(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.

(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128.

(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.

(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), pp. 2341-2352.

(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.

(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.

Anlage

Tabelle 1 Vergleich von K_oc -Werten für Böden und Klärschlämme, und mittels der HPLC-Screeningmethode (1) (2) berechneten Werten

Tabelle 2 Ergebnisse eines Ringversuchs (11 teilnehmende Laboratorien) zur Verbesserung und Validierung der HPLCMethode (1)

Tabelle 3 Empfohlene Referenzsubstanzen für die HPLC-Screeningmethode auf der Grundlage von Bodenadsorptionsdaten

weiter .