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C.23. 1. Methode

Diese Testmethode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 307 (2002)

C.23. 1.1 Einleitung

Die Testmethode basiert auf bestehenden Richtlinien (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Das in dieser Testmethode beschriebene Verfahren soll eine Evaluierung der aeroben und anaeroben Transformationsprozesse von Chemikalien im Boden ermöglichen. Die Tests sind so konzipiert, dass, (i) die Transformationsrate der Testsubstanz und (ii) die Art der Transformationsprodukte sowie Bildungs- und Abbauraten bestimmt werden. So können die Konzentrationen von Chemikalien, bzw. deren Transformationsprodukten, denen Pflanzen und Bodenorganismen ausgesetzt sein können, errechnet werden. Solche Untersuchungen sind für Chemikalien erforderlich, die direkt auf den Boden ausgebracht werden, bzw. bei denen die Möglichkeit besteht, dass sie in den terrestrischen Bereich gelangen.. Die Ergebnisse solcher Laboruntersuchungen können auch dazu genutzt werden, Probenahme- und Analysevorschriften für gleichgelagerte Feldstudien zu entwickeln.

Im Allgemeinen sind aerobe und anaerobe Untersuchungen mit einer Bodenart für die Untersuchung der Transformationspfade im Bodenausreichend (8)(10)(11). Die Transformationsraten sollten mit mindestens drei zusätzlichen Böden bestimmt werden (8)(10).

Auf einem OECD-Workshop zur Boden-/Sedimentauswahl, der 1995 im italienischen Belgirate stattfand (10), wurden insbesondere die Anzahl und Arten der in diesem Test zu verwendenden Böden vereinbart. Die im Test verwendeten Böden sollten repräsentativ für die im Freiland bei Chemikalieneinsatz bzw. - -eintrag exponierten Böden sein. So sollten etwa Chemikalien, die möglicherweise in subtropischem bis tropischem Klima freigesetzt werden, mit Ferrasolen oder Nitosolen (FAO-System) getestet werden. Des Weiteren gab der Workshop basierend auf der ISO-Anleitung (15) Empfehlungen zur Entnahme, Handhabung und Lagerung von Bodenproben. Die Verwendung von Reisböden ist in dieser Methode ebenfalls berücksichtigt.

C.23. 1.2 Definitionen

Testsubstanz: jede Substanz, ob Ausgangssubstanz oder relevante Transformationsprodukte.

Transformationsprodukte: alle Substanzen, die durch biotische oder abiotische Transformationsreaktionen der Testsubstanz entstehen, einschließlich CO₂ und Reaktionsprodukte in gebundenen Rückständen.

Gebundene Rückstände: "Gebundene Rückstände" sind Verbindungen in Boden, Pflanzen oder Tieren, die nach einer Extraktion in der Matrix in Form der Ausgangssubstanz oder deren Metaboliten/Transformationsprodukte(n) verbleiben. Die Extraktionsmethode darf die Verbindungen selbst oder die Matrixstruktur nicht wesentlich verändern. Durch matrixverändernde Extraktionsmethoden und hochentwickelte Analysenverfahren kann die Art der Bindung zum Teil geklärt werden. Bislang werden z.B. kovalente Ionen- und Sorptionsbindungen sowie Einschlüsse auf diese Weise nachgewiesen. In aller Regel bedeutet die Bildung von gebundenen Rückständen eine deutliche Verminderung der Bioverfügbarkeit (12) (modifiziert nach IUPAC 1984 (13)].

Aerobe Transformation: in Gegenwart von molekularem Sauerstoff ablaufende Reaktionen (14).

Anaerobe Transformation: unter Ausschluss von molekularem Sauerstoff ablaufende Reaktionen (14).

Boden: ein Gemisch mineralischer und organisch-chemischer Bestandteile, wobei letztere Verbindungen mit hohem Kohlenstoff- und Stickstoffgehalt sowie einem hohen Molekulargewicht enthalten und mit kleinen (zumeist Mikro-)Organismen belebt sind. Boden kann in zwei Zustandsformen bearbeitet werden:

1. ungestört, wie er sich im Laufe der Zeitentwickelt hat, mit der charakteristischer Horizontabfolge der verschiedenen Bodentypen;
2. gestört, wie er in der Regel auf landwirtschaftlich genutzten Flächen vorzufinden ist oder wie er vorkommt, wenn Proben durch Graben entnommen und in der beschriebenen Testmethode verwendet werden (14).

Mineralisation: vollständiger Abbau einer organischen Verbindung zu CO₂ und H₂O unter aeroben Bedingungen und zu CH₄, CO₂ und H₂O unter anaeroben Bedingungen. Im Zusammenhang mit dieser Testmethode, bei der eine¹⁴C-markierte Verbindung verwendet wird, bedeutet Mineralisation einen extensiven Abbau, wobei ein markiertes Kohlenstoffatom unter Freisetzung der entsprechenden Menge¹⁴CO₂ oxidiert wird (14).

Halbwertszeit t₀₅: die für die 50%ige Transformation einer Testsubstanz ermittelte Zeit, wenn die Transformation mittels Kinetik erster Ordnung beschrieben werden kann; sie ist konzentrationsunabhängig

Abbauzeit DT₅₀: Zeitspanne, in der sich die Konzentration der Testsubstanz um 50% reduziert hat; sie unterscheidet sich von der Halbwertszeit t_0,5, wenn die Transformation nicht nach der Kinetik erster Ordnung erfolgt.

Abbauzeit DT₇₅: Zeitspanne, in der sich die Testsubstanzkonzentration um 75% reduziert hat.

Abbauzeit DT₉₀: Zeitspanne, in der sich die Testsubstanzkonzentration um 90% reduziert hat.

C.23. 1.3 Referenzsubstanzen

Referenzsubstanzen sollten zur Charakterisierung und/oder zur Identifizierung von Transformationsprodukten mittels spektroskopischer und chromatographischer Verfahren verwendet werden.

C.23. 1.4 Anwendbarkeit des Tests

Die Methode ist auf sämtliche chemischen Substanzen (nichtmarkiert oder radioaktiv markiert) anwendbar, für die ein Analysenverfahren mit hinreichender Genauigkeit und Empfindlichkeit zur Verfügung steht. Sie ist anwendbar auf schwach flüchtige, nichtflüchtige, wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen. Bei Chemikalien, die aus Böden hochflüchtig sind (z.B. Begasungsmittel oder organische Lösungsmittel) und somit unter den Testbedingungen dieses Tests nicht im Boden gehalten werden können, sollte der Test nicht angewendet werden.

C.23. 1.5 Informationen zur Testsubstanz

Zur Messung der Transformationsrate kann nichtmarkierte oder markierte Testsubstanz verwendet werden. Markiertes Material ist zur Untersuchung des Umwandlungsweges und zur Aufstellung einer Massenbilanz notwendig. Empfohlen wird die¹⁴C-Markierung, doch auch der Einsatz anderer Isotope wie¹³C,¹⁵N,³H oder³²P kann sinnvoll sein. Die Markierung sollte möglichst im stabilsten Teil, bzw. in den stabilsten Teilen des Moleküls positioniert sein ¹. Der Reinheitsgrad der Testsubstanz sollte mindestens 95% betragen.

Vor der Durchführung eines Tests zur aeroben und anaeroben Transformation im Boden sollten folgende Informationen zur Testsubstanz vorliegen:

1. Wasserlöslichkeit (Methode A.6);
2. Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln:
3. Dampfdruck (Methode A.4) und Henry-Konstante;
4. n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (Methode A.8);
5. chemische Stabilität im Dunkeln (Hydrolyse) (Methode C.7);
6. pK_a, wenn ein Molekül zur Protonierung oder Deprotonierung neigt[OECD Guideline 112 ](16).

Außerdem können Angaben zur Toxizität der Testsubstanz gegenüber Bodenmikroorganismen sinnvoll sein [Testmethoden C.21 und C.22] (16).

Es sollten Analysenmethoden (einschließlich Extraktions und Reinigungsverfahren) zur Identifizierung und Quantifizierung der Testsubstanz sowie ihrer Transformationsprodukte verfügbar sein.

C.23. 1.6 Prinzip der Testmethode

Den Bodenproben wird die Testsubstanz zugefügt und die Proben werden im Dunkeln in einem Biometer-Gefäß oder einem Durchflusssystem unter kontrollierten Laborbedingungen (bei konstanter Temperatur und Bodenfeuchtigkeit) inkubiert. Nach entsprechenden Zeitintervallen werden die Bodenproben extrahiert und auf die Ausgangssubstanz und Transformationsprodukte analysiert. Außerdem werden flüchtige Produkte mit Hilfe geeigneter Absorptionsvorrichtungen für die Analyse gesammelt. Mittels¹⁴C-markiertem Material können die verschiedenen Mineralisationsraten von Testsubstanzen durch Auffangen von entstandenem¹⁴CO₂ gemessen werden und es kann eine Massenbilanz, einschließlich der Bildung von bodengebundenen Rückständen, aufgestellt werden.

C.23. 1.7 Qualitätskriterien

C.23. 1.7.1 Wiederfindungsraten

Die Extraktion und Analyse von mindestens zwei parallel angesetzten Bodenproben unmittelbar nach Zugabe der Testsubstanz, geben einen ersten Hinweis auf die Wiederholbarkeit der Analysenmethode und die gleichmäßige Verteilung der Testsubstanz bei der Applikation. Die Wiederfindungsraten für spätere Testphasen ergeben sich aus den jeweiligen Massenbilanzen. Die Wiederfindungsraten sollten im Bereich von 90-110% für markierte Chemikalien (8) und von 70-110% für nichtmarkierte Chemikalien (3) liegen.

C.23. 1.7.2 Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysenmethode

Die Wiederholbarkeit der Analysenmethode (ausgenommen die Effizienz der Extraktion im Anfangsstadium) zur Quantifizierung der Testsubstanz und der Transformationsprodukte kann durch eine parallele Analyse desselben Extrakts einer Bodenprobe, die hinreichend lange zur Bildung von Transformationsprodukten inkubiert wurde, überprüft werden.

Die Nachweisgrenze ("limit of detection; LOD") der Analysenmethode für die Testsubstanz und für die Transformationsprodukte sollte mindestens 0,01 mg kg Boden (als Testsubstanz) oder - falls dieser Wert niedriger ist - 1% der Applikationskonzentration betragen. Die Quantifizierungsgrenze ("limit of quantification; LOQ") sollte ebenfalls spezifiziert werden.

C.23. 1.7.3 Genauigkeit der Transformationsdaten

Geeignete Informationen über die Zuverlässigkeit der Transformationskurve lassen sich mittels Regressionsanalyse aus den Testsubstanzkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit gewinnen, die auch die Berechnung des Vertrauensbereichs für Halbwertszeiten (im Falle einer Kinetik pseudo-erster Ordnung) bzw. DT₅₀-Werte und ggf. für DT₇₅- und DT₉₀-Werte ermöglicht.

C.23. 1.8 Beschreibung der Testmethode

C.23. 1.8.1 Geräte und chemische Reagenzien

Inkubationssysteme bestehen aus statischen geschlossenen Systemen oder geeigneten Durchflusssystemen (7)(17). Beispiele für eine geeignete Durchfluss-Bodeninkubationssapparatur und ein Biometer-Gefäß sind in den Abb. 1 bzw. 2 dargestellt. Beide Arten von Inkubationssystemen haben Vorteile und Einschränkungen (7)(17).

Erforderlich ist die Standardlaborausstattung, insbesondere folgendes:

• Analysengeräte, z.B. GLC-, HPLC-, TLC-Ausstattung, einschließlich geeigneter Detektionssysteme für die Analyse radioaktiv markierter oder nichtmarkierter Substanzen oder für die inverse Isotopenverdünnungsmethode;
• Geräte für Identifizierungszwecke (z.B. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR);
• Flüssigkeitsszintillationszähler;
• Oxidiser für die Verbrennung von radioaktivem Material;
  Zentrifuge;
• Extraktionsgerät (z.B. Zentrifugengläser für die Kaltextraktion und ein Soxhlet-Apparat für die kontinuierliche Extraktion unter Rückfluss);
• Instrumente zum Einengen von Lösungen und Extrakten (z.B. Rotationsverdampfer);
• Wasserbad;
  Mechanische Mischvorrichtung (z.B. Knetmaschine, Rotationsmischer).

Einzusetzende chemische Reagenzien sind z.B.:

• NaOH, analysenrein, 2 mol dm^-3, oder eine andere geeignete base (z.B. KOH, Ethanolamin);
• H₃SO₄, analysenrein, 0,05 mol dm^-3;
• Ethylenglykol, analysenrein;
• feste Absorptionsmittel wie Natronkalk und Polyurethanstopfen;
• Organische Lösungsmittel, analysenrein, wie Aceton, Methanol usw.;
• Szintillationsflüssigkeit.

C.23. 1.8.2 Applikation der Testsubstanz

Für die Zugabe zum Boden und die Verteilung darin, kann die Testsubstanz in Wasser (entionisiert oder destilliert) oder - falls notwendig - in möglichst geringen Mengen Aceton oder anderen organischen Lösungsmitteln (6) gelöst werden, in denen die Testsubstanz hinreichend löslich und stabil ist. Die gewählte Lösungsmittelmengesollte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität der Bodenmikroorganismen haben (siehe Abschnitte 1.5 und 1.9.2-1.9.3). Die Verwendung von Lösungsmitteln, die die Aktivität der Bodenmikroorganismen hemmen, wie etwa Chloroform, Dichlormethan oder andere halogenierte Lösungsmittel, ist zu vermeiden.

Die Testsubstanz kann auch als Feststoff zugegeben werden, z.B. in Quarzsand (6) eingemischt oder in einer kleinen Teilprobe des Testbodens, die zuvor luftgetrocknet und sterilisiert wurde. Wird die Testsubstanz unter Verwendung eines Lösungsmittels zugegeben, muss das Lösungsmittel verdampfen können, bevor die Teilprobe der ursprünglichen nichtsterilen Bodenprobe zugesetzt wird.

Bei gebräuchlichen Chemikalien, deren Eintrag in den Boden hauptsächlich über Klärschlamm/Anwendung in der Landwirtschaft erfolgt, sollte die Testsubstanz zuerst dem Schlamm zugesetzt werden, der dann in die Bodenprobe eingebracht wird (siehe Abschnitte 1.9.2 und 1.9.3).

Die Verwendung von formulierten Handelsprodukten wird nicht routinemäßig empfohlen. Sie kann jedoch z.B. bei schlecht löslichen Testsubstanzen eine geeignete Alternative sein.

C.23. 1.8.3 Böden

C.23. 1.8.3.1 Bodenauswahl

Zur Bestimmung der Transformationswege kann ein repräsentativer Boden verwendet werden; empfohlen werden sandiger Lehm oder schluffiger Lehm oder Lehm oder lehmiger Sand [gemäß FAO und USDA-Klassifikation(18)] mit einem pH-Wert von 5,5-8,0, einem organischen Kohlenstoffgehalt von 0,5-2,5 % und einer mikrobiellen Biomasse von mindestens 1 % des gesamten organischen Kohlenstoffs (10).

Zur Untersuchung der Transformationssraten sollten mindestens drei zusätzliche Böden verwendet werden, die einen Bereich allerrelevanter Böden repräsentieren. Die Böden sollten sich hinsichtlich des organischen Kohlenstoffgehalts, des pH-Werts, des Tongehalts und der mikrobiellen Biomasse voneinander unterscheiden (10).

Alle Böden sollten mindestens hinsichtlich folgender Eigenschaften charakterisiert werden: Textur (% Sand, % Schluff, % Ton) [gemäß FAO und der USDA-Klassifikation (18)], pH-Wert, Kationenaustauschkapazität, organischer Kohlenstoffgehalt, Bodendichte, Wasserrückhalteeigenschaft ² und mikrobielle Biomasse (nur für aerobe Untersuchungen). Zusätzliche Informationen über Bodeneigenschaften können für die Interpretation der Ergebnisse von Nutzen sein. Zur Bestimmung der Bodeneigenschaften können die in den Literaturangaben (19)(20)(21)(22)(23) empfohlenen Methoden herangezogen werden. Die mikrobielle Biomasse sollte mit Hilfe der Substrat-induzierten Respirationsmethode (SIR) (25)(26) oder alternativer Verfahren (20) bestimmt werden.

C.23. 1.8.3.2 Probenahme, Handhabung und Lagerung von Böden

Es sind ausführliche Informationen über die Geschichte des Feldstandorts erforderlich, von dem der Testboden entnommen wird. Die Angaben betreffen unter anderem die genaue Lage, den Bewuchs, Behandlungen mit Chemikalien sowie mit organischen und anorganischen Düngemitteln, Zusätze biologischer Materialien oder anderer Verunreinigungen. Böden, die in den vorhergehenden vier Jahren mit der Testsubstanz oder ihren Struktur-Analoga behandelt worden sind, sollten nicht für die Transformationsuntersuchungen verwendet werden (10)(15).

Der Boden sollte feldfrisch entnommen werden (aus dem A-Horizont oder bis zu einer Tiefe von maximal 20 cm) und einen Bodenwassergehalt aufweisen, der das Sieben ermöglicht. Bei Böden, die nicht von Reisfeldern stammen, sollte die Probenahme während oder unmittelbar nach längeren (> 30 Tage) Dürre-, Frost- oder Überschwemmungsperioden vermieden werden (14). Die Proben sollten so transportiert werden, dass der Bodenwassergehalt möglichst unverändert bleibt, und sie sollten unter freiem Luftzutritt dunkel aufbewahrt werden. Im Allgemeinen ist ein locker verschlossener Polyethylenbeutel geeignet.

Der Boden sollte so schnell wie möglich nach der Probenahme bearbeitet werden. Vegetationsreste, größere Bodentiere und Steine sollten entfernt werden, bevor der Boden durch ein Sieb mit 2 mm Maschenweite gegeben wird, um kleine Steine, Bodentiere und Pflanzenteile zu entfernen. Ein übermäßiges Austrocknen und Zerkleinern des Bodens vor dem Sieben ist zu vermeiden (15).

Wenn die Probenahme auf dem Feld im Winter schwierig ist (Boden gefroren oder schneebedeckt), kann auf Boden zurückgegriffen werden, der im Gewächshaus unter einer Pflanzenabdeckung (Gras oder Gras-Klee-Mischung) gelagert wurde. Untersuchungen mit feldfrischen Böden werden in jedem Fall bevorzugt, doch wenn der entnommene und bearbeitete Boden vor Beginn der Untersuchungen gelagert werden muss, dann unter angemessenen Bedingungen und nur für eine begrenzte Dauer (höchstens drei Monate bei 4 ± 2 °C), um die mikrobielle Aktivität zu erhalten ³. Ausführliche Anweisungen zur Probenahme, Handhabung und Lagerung von Böden für Untersuchungen der Biotransformation sind zu finden in (8)(10)(15)(26)(27).

Bevor der bearbeitete Boden für diesen Test verwendet wird, sollte er vorinkubiert werden, um das Keimen und Entfernen von Samen zu ermöglichen, und im Anschluss an den Wechsel von den Probenahme- oder Lagerungsbedingungen zu den Inkubationsbedingungen wieder ein Gleichgewicht des Mikrobenstoffwechsels herzustellen. Im Allgemeinen ist eine Vorinkubationsdauer von 2 bis 28 Tagen unter annähernder Einhaltung der Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen des eigentlichen Tests ausreichend (15). Lagerung und Vorinkubation sollten zusammengenommen nicht länger als drei Monate dauern.

C.23. 1.9 Durchführung des Tests

C.23. 1.9.1 Testbedingungen

C.23. 1.9.1.1 Testtemperatur

Während der gesamten Testdauer sollten die Böden im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur inkubiert werden, die für die klimatischen Bedingungen, unter denen der Einsatz bzw. die Freisetzung erfolgt, repräsentativ ist. Für alle Testsubstanzen, die in gemäßigten Klimazonen in den Boden gelangen können, wird eine Temperatur von 20 ± 2 °C empfohlen. Die Temperatur sollte überwacht werden.

Bei Chemikalien, die in kälteren Klimazonen angewandt bzw. eingetragen werden (z.B. in nördlichen Ländern oder während des Herbstes/Winters), sollten zusätzlich Bodenproben bei einer niedrigeren Temperatur inkubiert werden (z.B. 10 ± 2 °C).

C.23. 1.9.1.2 Feuchtegehalt

Bei Transformationstests unter aeroben Bedingungen sollte der Feuchtegehalt ⁴ des Bodens auf einen pF-Wert von 2,0 bis 2,5 eingestellt und bei diesem Wert gehalten werden (3). Der Feuchtegehalt des Bodens wird als Masse Wasser pro Masse Boden (Trockengewicht) ausgedrückt und sollte regelmäßig kontrolliert werden (z.B. alle zwei Wochen), indem die Inkubationsgefäße gewogen und Wasserverluste ersetzt werden (vorzugsweise mit sterilfiltriertem Leitungswasser). Es ist darauf zu achten, dass während der Zugabe von Feuchtigkeit Verluste von Testsubstanz und/oder Transformationsprodukten durch Verflüchtigung und/oder ggf. photochemischen Abbau möglichst verhindert oder minimiert werden .

Für Transformationstests unter anaeroben und Reisanbaubedingungen wird der Boden durch Überflutung mit Wasser gesättigt.

C.23. 1.9.1.3 Aerobe Inkubationsbedingungen

Bei Durchflusssystemen werden aerobe Bedingungen durch diskontinuierliches Spülen oder kontinuierliches Belüften mit befeuchteter Luft aufrechterhalten. In Biometer-Gefäßen wird der ständige Austausch von Luft durch Diffusion ermöglicht.

C.23. 1.9.1.4 Sterile aerobe Bedingungen

Um Informationen über die Relevanz der abiotischen Transformation einer Testsubstanz zu gewinnen, können Bodenproben sterilisiert (zu Sterilisationsverfahren vgl. (16) und (29)), mit einer sterilen Testsubstanz behandelt (z.B. Zugabe der Lösung durch ein Sterilfilter) und mit steriler befeuchteter Luft, wie in Abschnitt 1.9.1.3 beschrieben, belüftet werden. Bei Reisböden sollten Boden und Wasser sterilisiert und die Inkubation wie in Abschnitt 1.9.1.6 beschrieben durchgeführt werden.

C.23. 1.9.1.5 Anaerobe Inkubationsbedingungen

Zum Erreichen und Aufrechterhalten anaerober Bedingungen wird der mit der Testsubstanz behandelte und unter aeroben Bedingungen für 30 Tage bzw. eine Halbwertszeit oder DT₅₀ (je nachdem, was kürzer ist) inkubierte Boden mit Wasser überflutet (Wassersäule 1-3 cm), und das Inkubationssystem wird mit einem inerten Gas (z.B. Stickstoff oder Argon) gespült ⁵. Das Testsystem muss Messungen z.B. des pH-Werts, der Sauerstottkonzentration und des Redoxpotenzials ermöglichen und Absorptionsfallen für flüchtige Reaktionsprodukte beinhalten. Das Biometersystem muss geschlossen sein, um den Zutritt von Luft durch Diffusion zu vermeiden.

C.23. 1.9.1.6 Inkubation unter Reisfeldbedingungen

Zur Untersuchung der Transformation in Reisfeldböden wird der Boden mit einer Wassersäule von etwa l-5 cm Höhe überflutet und die Testsubstanz in die Wasserphase appliziert (9). Es wird eine Bodentiefe von mindestens 5 cm empfohlen. Das System wird mit Luft wie unter aeroben Bedingungen belüftet. Der pH-Wert, die Sauerstoftkonzentration und das Redoxpotenzial der Wassersäule sollten überwacht und aufgezeichnet werden. Vor der Aufnahme der Transformationsuntersuchungen ist eine Vorinkubationsdauer von mindestens zwei Wochen erforderlich (siehe Abschnitt 1.8.3.2).

C.23. 1.9.1.7 Testdauer

Die Untersuchungen zu Geschwindigkeit und Transformationsverlauf sollten nicht länger als 120 Tage dauern ⁶ (3)(6)(8), da danach in einem künstlichen Laborsystem, isoliert von natürlichen Revitalisierungsprozessen, eine Abnahme der mikrobiellen Aktivität im Boden mit der Zeit zu erwarten wäre. Falls es für die Charakterisierung des Testsubstanzabbaus sowie der Bildung und des Abbaus der Transformationsprodukte erforderlich ist , können die Untersuchungen über längere Zeiträume fortgesetzt werden (z.B. 6 oder 12 Monate) (8). Längere Inkubationszeiten sollten im Testbericht begründet und durch Biomassemessungen im Verlaufe und am Ende dieser Zeiträume begleitet werden .

C.23. 1.9.2 Durchführung des Tests

In jedes Inkubationsgefäß werden etwa 50 bis 200 g Boden (Bezugsbasis Trockengewicht) gegeben (siehe Abbildungen 1 und 2 in Anhang 3), und der Boden wird nach einem der in Abschnitt 1.8.2 beschriebenen Verfahren mit der Testsubstanz behandelt. Werden organische Lösungsmittel für die Applikation der Testsubstanz verwendet, sollten sie durch Verdampfen aus dem Boden entfernt werden. Anschließend wird der Boden mit einem Spatel und/oder durch Schütteln des Gefäßes gründlich durchmischt. Wird die Untersuchung unter Reisfeldbedingungen durchgeführt, sollten Boden und Wasser nach Applikation der Testsubstanz gründlich gemischt werden. Zur Überprüfung der gleichmäßigen Verteilung sollten kleine Allquoten (z.B. 1 g) des behandelten Bodens auf die Testsubstanzgehalte analysiert werden. Angaben zu einem alternativen Verfahren siehe unten.

Die Testkonzentration sollte der höchsten Anwendungsrate eines Pflanzenschutzmittels laut den Empfehlungen in der Gebrauchsanleitung und einer gleichmäßigen Einarbeitung in eine geeignete Tiefe im Feld (z.B. bis zu einer Tiefe von 10 cm ⁷ in den Boden) entsprechen. So beträgt z.B. bei Chemikalien, die auf die Blätter oder den Boden ohne Einarbeitung ausgebracht werden, die geeignete Tiefe für die Berechnung der in jeden Gefäß zu gebenden Chemikalie 2,5 cm. Bei in den Boden eingearbeiteten Chemikalien ist die geeignete Tiefe die in der Gebrauchsanleitung genannte Einarbeitungstiefe. Für Chemikalien im allgemeinen sollte die Applikationsrate basierend auf dem Haupteintragspfad gewählt werden. Wenn z.B. der Eintrag in den Boden hauptsächlich über Klärschlamm erfolgt, sollte die Chemikalie im Schlamm so dosiert werden, dass ihre Konzentration im Verhältnis zu der erwarteten Schlammkonzentration steht, und der dem Boden zugegebene Schlamm sollte im Verhältnis zum üblichen Schlammeintrag in landwirtschaftlich genutzte Böden stehen. Ist diese Konzentration nicht hoch genug, um die wichtigsten Transformationsprodukte nachzuweisen, kann eine Inkubation gesonderter Bodenproben mit höheren Mengen hilfreich sein, doch sollten zu hohe Mengen, die die Funktionen der Bodenmikroorganismen beeinflussen, vermieden werden (siehe Abschnitte 1.5 und 1.8.2).

Alternativ kann eine größere Charge (d. h. 1 bis 2 kg) Boden mit der Testsubstanz behandelt werden; dieser Ansatz wird in einem geeigneten Mischgerät sorgfältig gemischt und anschließend in kleinen Teilen von 50 bis 200 g in die Inkubationsgefäße gegeben (z.B. unter Verwendung von Probenteilern). Zur Überprüfung der gleichmäßigen Verteilung sollten kleine Aliquoten (z.B. 1 g) des behandelten Bodens auf die Testsubstanzgehalte analysiert werden. Ein solches Verfahren wird bevorzugt, da es eine gleichmäßigere Verteilung der Testsubstanz im Boden ermöglicht.

Zusätzlich zu den mit Testsubstanz behandelten Proben werden unbehandelte Bodenproben unter den gleichen Bedingungen (aerob) inkubiert . Diese Proben werden zur Messung der Biomasse im Verlaufe und am Ende der Untersuchungen herangezogen.

Wird die Testsubstanz mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels/ mehrerer organischer Lösungsmittel gelöst auf den Boden aufgebracht, werden mit der gleichen Menge des Lösungsmittels (der Lösungsmittel) behandelte Bodenproben unter den gleichen Bedingungen (aerob) inkubiert, wie die mit der Testsubstanz behandelten Proben. Diese Proben werden zur Biomassemessung zu Testbeginn, während des Tests und zu Testende herangezogen, um die Wirkungen des Lösungsmittels/der Lösungsmittel auf die mikrobielle Biomasse zu prüfen.

Die den behandelten Boden enthaltenden Gefäße werden entweder an das in Abbildung 1 dargestellte Durchflusssystem angeschlossen oder mit der in Abbildung 2 gezeigten Absorptionskolonne verschlossen (siehe Anhang 3).

C.23. 1.9.3 Probenahme und Messung

Parallel-Inkubationsgefiiße werden in entsprechenden Zeitintervallen entnommen und die Bodenproben mit geeigneten Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität extrahiert und auf die Testsubstanz und/oder Transformationsprodukte analysiert. Bei einer gut konzipierten Untersuchung ist eine ausreichende Zahl von Gefäß vorgesehen, so dass zu jedem Probenahmetermin zwei Gefäße entnommen werden. Zudem werden in verschiedenen Zeitintervallen (7-Tage-Intervalle während des ersten Monats und 17-Tage-Intervalle nach einem Monat) Absorptionslösungen bzw. feste Absorptionsmittel im Verlaufe und am Ende der Inkubation jeder Bodenprobe entfernt und auf flüchtige Produkte analysiert. Abgesehen von einer unmittelbar nach der Applikation (0-Tage-Probe) genommenen Bodenprobe sollten mindestens 5 zusätzliche Probenahmetermine vorgesehen sein. Die Zeitintervalle sollten derart ausgewählt werden, dass ein Abbauschema für die Testsubstanz und ein Bildungs- und Abbauschema für die Transformationsprodukte erstellt werden können (z.B. 0, 1, 3, 7 Tage; 2, 3 Wochen; 1, 2, 3 Monate usw.).

Wird eine¹⁴C-markierte Testsubstanz verwendet, wird die nichtextrahierbare Radioaktivität durch Verbrennung quantifiziert, und für jedes Probenahmeintervall wird eine Massenbilanz berechnet.

Im Falle einer anaeroben Inkubation sowie einer Inkubation unter Reisfeldbedingungen werden die Boden- und Wasserphasen gemeinsam auf die Testsubstanz und Transformationsprodukte analysiert oder vor der Extraktion und Analyse durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt.

C.23. 1.9.4 Fakultative Test

Aerobe, nichtsterile Untersuchungen bei zusätzlichen Temperaturen und Bodenfeuchten können sinnvoll sein, wenn es darum geht, den Einfluss von Temperatur und Bodenfeuchte auf die Transformationsgeschwindigkeit einer Testsubstanz und/oder ihrer Transformationsprodukte im Boden abzuschätzen.

Eine weitere Charakterisierung von nichtextrahierbarer Radioaktivität kann z.B. mittels überkritischer Flüssigextraktion versucht werden.

C.23. 2 Daten

C.23. 2.1 Aufbereitung der Ergebnisse

Die Konzentrationen der Testsubstanz, Transformationsprodukte, flüchtigen Substanzen (nur in %) und nichtextrahierbaren Substanzen sollten in % der applizierten Ausgangskonzentration und ggf. in mg×kg^-1 Boden (Bezugsbasis Trockengewicht) für jedes Probenahmeintervall angegeben werden. Eine Massenbilanz in Prozent, bezogen auf die Ausgangskonzentration sollte für jedes Probenahmeintervall erstellt werden. Eine graphische Darstellung der Testsubstanzkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit wird eine Einschätzung der Transformationshalbwertszeit bzw. der DT₅₀ ermöglichen. Die Haupttransformationsprodukte sollten identifiziert und ihre Konzentrationen ebenfalls über der Zeit aufgetragen werden, um die jeweilige Geschwindigkeit ihrer Bildung und ihres Abbaus aufzuzeigen. Ein Haupttransformationsprodukt ist jedes Reaktionsprodukt, das zu irgendeinem Zeitpunkt des Tests mit einer Konzentration e 10 % der Applikationskonzentration vorliegt.

Die aufgefangenen flüchtigen Produkte geben Hinweise auf das Flüchtigkeitspotenzial einer Testsubstanz und ihrer Transformationsprodukte im Boden.

Eine genauere Bestimmung der Halbwertszeiten bzw. DT₅₀-Werte und ggf. DT₇₅- und DT₉₀-Werte sollte durch die Anwendung geeigneter Kinetikmodellberechnungen möglich sein. Die Halbwertszeiten und DT₅₀-Werte sollten zusammen mit der Beschreibung des verwendeten Modells, der Kinetikordnung und des Determinationskoeffizienten (r²) angegeben werden. Bevorzugt wird die Kinetik erster Ordnung, sofern nicht r² < 1,7. Ggf. sollten die Berechnungen auch bei den Haupttransformationsprodukten angewendet werden. Beispiele für zweckmäßige Modelle sind in den Literaturangaben 31 bis 35 beschrieben.

Wurden Untersuchungen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt,sollten die Transformationsraten in Abhängigkeit von der Temperatur, innerhalb des eingesetzten experimentellen Temperaturbereichs dargestellt werden, und zwar unter Verwendung der Arrhenius-Gleichung, in der Form:

wobei In a und B Regressionskonstanten aus dem Achsenabschnitt bzw. der Steigung einer Ausgleichsgeraden sind, die durch lineare Regression von In k gegen l/T erzeugt wird. k ist die Geschwindigkeitskonstante bei der Temperatur T und T ist die Temperatur in Kelvin ist. Es ist auf den begrenzten Temperaturbereich zu achten, in dem die Arrhenius-Gleichung gültig ist, wenn die Transformation auf mikrobieller Aktivität beruht.

C.23. 2.2 Evaluierung und Interpretation der Ergebnisse

Obwohl die Untersuchungen in einem künstlichen Laborsystem stattfinden, lassen die Ergebnisse doch eine Einschätzung der Transformationsrate der Testsubstanz und auch der Bildungs- und Abbaurate der Transformationsprodukte unter Feldbedingungen zu (36)(37).

Eine Untersuchung der Transformationswege einer Testsubstanz vermittelt Erkenntnisse über die Art und Weise wie die Substanz im Boden in ihrer Struktur durch chemische und mikrobielle Reaktion verändert wird.

C.23. 3 Abschlussbericht

Testbericht

Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:

Testsubstanz:

• Common Name (Handelsname von Pflanzenschutzmitteln), systematischer chemischer Name, CASNummer, Strukturformel (bei Verwendung radioaktiv markierter Chemikalien Angabe des Markierungsortes) und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften (siehe Abschnitt 1.5);
• Reinheit (Verunreinigungen) der Testsubstanz;
• für markierte Chemikalien: radiochemische Reinheit und spezifische Aktivität (falls zutreffend);

Referenzsubstanzen:

• systematischer chemischer Name und Struktur der Referenzsubstanzen, die zur Charakterisierung und/oder Identifizierung von Transformationsprodukten verwendet werden;

Testböden:

• Angaben zum Probenahmeort;
• Datum und Verfahren der Probenahme;
  Bodeneigenschaften, z.B. pH-Wert, organischer Kohlenstoffgehalt, Textur (% Sand, % Schluff, % Ton), Kationenaustauschkapazität, Bodendichte, Wasserrückhalteeigenschaft und mikrobielle Biomasse;
• ggf. Lagerungsdauer und -bedingungen;

Testbedingungen:

• Angabe aller Kalenderdaten in Zusammenhang mit der Testdurchführung;

Applikationsmenge der Testsubstanz;

• verwendete Lösungsmittel und Art der Testsubstanzapplikation;
• Bodengewicht zu Testbeginn und zu jedem Probenahmetermin, der Analytik einschließt; Beschreibung des verwendeten Inkubationssystems;
  Luftdurchflussrate (nur für Durchflusssysteme);
• Versuchstemperatur;
• Bodenfeuchtegehalt während der Inkubation;
• mikrobielle Biomasse zu Beginn, im Verlaufe und am Ende der aeroben Untersuchungen;
  pH-Wert, Sauerstoffkonzentration und Redoxpotenzial zu Beginn, im Verlaufe und am Ende der anaeroben Untersuchungen und der Untersuchungen unter Reisfeldbedingungen;
• Extraktionsverfahren;
  Quantifizierungs- und Identifizierungsverfahren für die Testsubstanz und die Haupttransformationsprodukte im Boden und in den Absorptionsmitteln;
• Anzahl der Replikate und der Kontrollansätze.

Ergebnisse:

• Ergebnis der Bestimmung der mikrobiellen Aktivität;
• Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der herangezogenen Analysenmethoden;
  Wiederfindungsraten (Werte in % für eine valide Untersuchung sind in Abschnitt 1.7.1 angegeben);
• tabellarische Darstellung der Ergebnisse in % der applizierten Ausgangskonzentration und ggf. in mg×kg^-1 Boden (bezogen auf Trockengewicht);
• Massenbilanz während und am Ende der Untersuchungen;
• Charakterisierung nichtextrahierbarer (gebundener) Radioaktivität bzw. Rückstände im Boden;
• Quantifizierung von freigesetztem CO₂ und anderer flüchtiger Verbindungen;
  graphische Darstellungen von Bodenkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit für die Testsubstanz und ggf. für die Haupttransformationsprodukte;
• Halbwertszeit oder DT₅₀, DT₇₅ und DT₉₀ für die Testsubstanz und ggf. für die Haupttransformationsprodukte einschließlich Vertrauensbereichen;
  Einschätzung der der abiotischen Abbaurate unter sterilen Bedingungen;
• Beurteilung der Transformationskinetik für die Testsubstanz und ggf. für die Haupttransformationsprodukte;
• Angabe von Transformationspfaden (falls möglich);
• Diskussion und Interpretation der Ergebnisse;
• Rohdaten (d. h. Chromatogramme der einzelnen Proben, Berechnungen der Transformationsraten sowie Methoden zur Identifizierung von Transformationsprodukten).

C.23. 4 Literaturangaben

(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.

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Anhang 1
Wasserspannung, Feldkapazität (FK) und Wasserhaltekapazität (WHK) *

Die Wasserspannung(Saugspannung) wird in cm Wassersäule oder in bar gemessen. Aufgrund des großen Saugspannungsbereichs wird sie einfach als pF-Wert angegeben, der dem Logarithmus der in cm Wassersäule angegebenen Wasserspannung entspricht.

Die Feldkapazität (Speichelfeuchte) wird definiert als die Wassermenge, die ein natürlicher Boden nach längeren Niederschlägen oder nach ausreichender Bewässerung zwei Tage gegen die Gravitation speichern kann. Sie wird in ungestörtem Boden in situ im Feld bestimmt. Daher ist die Messung nicht auf gestörte Laborbodenproben anwendbar. In gestörtem Boden bestimmte FK-Werte können erhebliche systematische Varianzen aufweisen.

Die Wasserhaltekapazitäl (WHK) wird im Labor für ungestörten und gestörten Boden durch Sättigung einer Bodensäule mit Wasser durch Kapillaraufstieg bestimmt. Sie ist besonders für gestörte Böden nützlich und kann bis zu 30 % größer sein als die Feldkapazität (1). Sie ist im Test auch leichter zu bestimmen als verlässliche FK-Werte.

Anhang 2
Bodenfeuchtegehalt (in g Wasser je 100 g Boden TG¹) Verschiedener Bodenarten aus unterschiedlichen Ländern

Anhang 3

Abbildung 1 Beispiel eines Durchflussapparats für die Untersuchung der Transformation von Chemikalien im Boden^1,2

1: Nadelventil

2: mit Wasser gefüllte Gaswaschflasche

3: Ultramembran (nur sterile Bedingungen), Porengröße 0,2 µm

4: Bodenstoffwechselgefäß (mit Wasserüberstand nur für anaerobe und Reisfeldbedingungen;)

5: Ethylenglykolabscheider für flüchtige organische Verbindungen

6: Schwefelsäureabscheider für flüchtige Alkalien

7, 8: Natriumhydroxidabscheider für CO₂ und andere flüchtige saure Verbindungen

9: Durchflussmesser

Abbildung 2 Beispiel eines Biometer-Gefäßes für die Untersuchung der Transformation von Chemikalien im Boden³

1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.

2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fitte of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.

3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.

1) Wenn beispielsweise die Testsubstanz einen Ring enthält, muss sich die Markierung auf diesem Ring befinden; enthält die Testsubstanz zwei oder mehr Ringe, können gesonderte Untersuchungen erforderlich sein, um den Verbleib jedes markierten Ringes zu erfassen und sachgerechte Informationen zur Bildung von Transformationsprodukten zu gewinnen.

2) Die Wasserrückhalteeigenschaft eines Bodens lässt sich als Feldkapazität, als Wasserhaltekapazität oder als Wassersaugspannung (pF) messen. Erläuterungen siehe Anhang 1. Im Testbericht ist festzuhalten, ob die Wasserrückhalteeigenschaft und die Bodendichte von Böden bei ungestörten Feldproben oder gestörten (bearbeiteten) Proben ermittelt wurden.

3) Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Böden aus den gemäßigten Klimazonen bei -20 °C sogar mehr als drei Monate gelagert werden können (28)(29), ohne dass die mikrobielle Aktivität wesentlich zurückgeht.

4) Der Boden sollte weder zu feucht noch zu trocken sein, um eine adäquate Belüftung und Ernährung der Bodenmikroflora zu gewährleisten. Für ein optimales Wachstum der Bodenmikroorganismen wird ein Feuchtegehalt von 40 - 60% der Wasserhaltekapazität (WHK) und von 0,1 - 0,33 bar empfohlen (6). Der letztere Bereich entspricht einem pF-Bereich von 2,0 - 2,5. Typische Feuchtegehalte verschiedener Bodenarten sind in Anhang 2 aufgeführt.

5) Wie ein von der EU gefördertes Forschungsprojekt gezeigt hat, herrschen in Oberböden und selbst in Böden aus Tiefenschichten aerobe Bedingungen vor IK. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17.-21. August 1992, Sigtuna, Schwedenl. Anaerobe Bedingungen kommen nur gelegentlich bei Überschwemmungen von Böden nach schweren Niederschlägen oder bei der Herstellung von Anbaubedingungen auf Reisfeldern vor.

6) Aerobe Untersuchungen können weit vor Ablauf von 120 Tagen beendet werden, wenn zu diesem Zeitpunkt der Abbauweg eindeutig identifiziert wurde und die vollständige Mineralisation erreicht worden ist. Beendet werden kann der Test nach 120 Tagen oder wenn mindestens 90% der Testsubstanz umgewandelt sind, jedoch nur, wenn sich mindestens 5 % CO₂ gebildet haben.

7) Die Berechnung der Ausgangskonzentration eines Standortes beruht auf folgender Gleichung:

C_soil= Ausgangskonzentration im Boden [mg kg^-1]

a = Aufwandrate [kg · ha^-1 1; l = Dicke der Bodenschicht am Feldstandort [m]; d = Bodendichte des trockenen Bodens [kg m^-3].

Als Faustregel gilt, dass eine Aufwandrate von 1 kg ha^-1 in einer Bodenkonzentration von ca. 1 mg kg^-1 in einer 10 cm-Schicht resultiert (ausgehend von einer Bodendichte von 1 g · cm³).

 * Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.

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