umwelt-online: Bestimmung der Toxizität

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B.20. 1. Methode

B.20. 1.1. Einleitung

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B.

B.20. 1.2. Definitionen

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B; B

B.20. 1.3. Bezugssubstanzen

Keine.

B.20. 1.4. Prinzip der Methode

Mit dem Test zur Erfassung geschlechtsgebundener rezessiver Letalmutationen (sex-linked recessive lethal test = SLRL-Test) an Drosophila melanogaster lassen sich Mutationen - sowohl Punktmutationen als auch kleine Deletionen - in der Keimbahn des Insektes feststellen. Es handelt sich um einen Vorwärtsmutationenstest, mit dem eine Untersuchung auf Mutationen an etwa 800 Loci auf dem X-Chromosom (etwa 80 % aller X-Chromosom-Loci) möglich ist. Das X-Chromosom enthält etwa ein Fuenftel des gesamten haploiden Genoms.

Mutationen im X-Chromosom von Drosophila melanogaster werden in männlichen Trägern des Mutantengens phänorypisch exprimiert. Wenn eine letale Mutation in hemizygotem Zustand vorliegt, fehlt eine der beiden Klassen männlicher Nachkommen, die ein heterozygotes Weibchen normalerweise hervorbringt. Im SLRL-Test erkennt man diese Tatsachen mit Hilfe besonders markierter und angeordneter Chromosomen.

B.20. 1.5. Qualitätskriterien

Keine.

B.20. 1.6. Beschreibung der Methode

Vorbereitung

Zuchten

Es können Männchen einer genau definierten Wildtypzucht und Weibchen der Zucht Muller-5 verwendet werden. Auch die Verwendung von anderen entsprechend markierten Weibchen mit multiplen invertierten X-Chromosomen ist möglich.

Prüfsubstanz

Die Prüfsubstanzen sind in Wasser zu lösen. Wasserunlösliche Substanzen können in geeigneten Lösungsmitteln (z.B. einer Mischung aus Ethanol und Tween-60 oder 80) gelöst oder suspendiert und dann vor der Verabreichung mit Wasser oder Kochsalzlösung verdünnt werden. Die Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel ist zu vermeiden.

Anzahl der Tiere

Empfindlichkeit und Signifikanzgrad des Tests sind vorher festzulegen. Die Anzahl der zu analysierenden behandelten Chromosomen hängt in hohem Maß von der spontanen Mutationsrate in entsprechenden Kontrollen ab.

Behandlung

Die Verabreichung kann oral, durch Injektion oder durch Exposition gegenüber Gasen oder Dämpfen erfolgen. Bei oraler Verabreichung kann die Prüfsubstanz in Zuckerlösung gegeben werden. Erforderlichenfalls können die Substanzen in einer 0,7 %igen NaCl-Lösung gelöst und in Thorax oder Abdomen injiziert werden.

Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen

Negativ- (Vehikel-) und Positivkontrollen sind zu verwenden. Stehen jedoch entsprechende Laborkontrollen zur Verfügung, sind keine gleichzeitigen Kontrollen erforderlich.

Konzentrationen

Es sind drei Konzentrationen zu verwenden. Zur vorläufigen Abschätzung kann eine einzige Konzentration verwendet werden, und zwar entweder die höchste noch verträgliche Konzentration der Prüfsubstanz oder eine Konzentration, die gewisse Toxizitätsanzeichen hervorruft. Bei nichttoxischen Substanzen sollte die Behandlung gegenüber der höchstmöglichen Konzentration erfolgen.

Versuchsdurchführung

Wildtypmännchen (3 bis 5 Tage alt) werden mit der Prüfsubstanz behandelt und einzeln mit mehreren jungfräulichen Weibchen aus der Muller-5-Zucht oder aus einer anderen entsprechend markierten Zucht (mit multiplen invertierten X-Chromosomen) gepaart. Die Weibchen werden alle zwei bis drei Tage durch neue jungfräuliche Tiere ersetzt, um den gesamten Keimzellzyklus abzudecken. Durch die Untersuchung der Nachkommen dieser Weibchen werden Letaleffekte in reifen Spermien, Spermatiden des mittleren oder späten Stadiums, frühen Spermatiden, Spermatozyten und Spermatogonien der behandelten Männchen erfaßt.

Heterozygote F₁-Weibchen aus den obigen Kreuzungen werden einzeln (d. h. ein Weibchen pro Flasche) mit ihren Brüdern gepaart. In der F₂-Generation wird in jeder Kultur festgestellt, ob Wildtypmännchen auftreten oder nicht. Gelangt man aufgrund der Tatsache, daß in einer Kultur keine F₂-Männchen mit dem behandelten Chromosomen (Wildtyp) beobachtet werden, zu der Annahme, daß das F₁-Weibchen Träger eines Letalgens im väterlichen X-Chromosom ist, sind die Töchter dieses Weibchens mit dem gleichen Genotyp zu testen, um festzustellen, ob die Letalität auch in der nächsten Generation wieder auftritt.

B.20. 2. Daten

Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Anzugeben ist die Anzahl der getesteten X-Chromosomen, die Anzahl der unfruchtbaren Männchen und die Anzahl der Letalmutationen für jede Konzentration, für jede Paarungsperiode und jedes behandelte Männchen. Auch sind Cluster verschiedener Größen pro Männchen anzugeben. Die Versuchsergebnisse sind in einem getrennten Versuch zu bestätigen.

Bei der Auswertung der SLRL-Tests sind geeignete statistische Verfahren zu verwenden. Cluster-Bildung rezessiver Letalmutationen, die von einem Männchen ausgehen, sind mit einem geeigneten statistischen Verfahren zu untersuchen und auszuwerten.

B.20. 3. Abschlußbericht

B.20. 3.1. Prüfbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• Zucht: verwendete Drosophilazuchten oder -stämme, Alter der Insekten, Anzahl der behandelten Männchen, Anzahl der sterilen Männchen, Anzahl der etablierten F₂-Kulturen, Anzahl der F₂-Kulturen ohne Nachkommen, Anzahl der in den einzelnen Keimzellstadien festgestellten Chromosomen mit einer Letalmutation;
• Kriterien für die Festlegung der Größe der behandelten Gruppen;
• Versuchsbedingungen: eingehende Beschreibung des Behandlungs- und Stichprobenentnahmeplans, Expositionskonzentrationen, Toxitätsdaten, ggf. Negativ-(Lösungsmittel-) und Positivkontrollen;
• Kriterien für die Erfassung der Letalmutationen;
• ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;
• statistische Auswertung;
• Diskussion der Ergebnisse;
• Bewertung der Ergebnisse.

B.20. 3.2. Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung Teil B.

B.20. 4. Literatur

Siehe allgemeine Einleitung Teil B; H

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