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(siehe auch: DGUV Information 213-093 - Zellkulturen - Einstufung biologischer Arbeitsstoffe)
- Bek. d. BMAS - IIIb 3-34504-7 -

Die Technischen Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA) geben den Stand der Technik, Arbeitsmedizin und Arbeitshygiene sowie sonstige gesicherte arbeitswissenschaftliche Erkenntnisse für Tätigkeiten mit Biologischen Arbeitsstoffen wieder.

Sie werden vom

Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe

ermittelt bzw. angepasst und vom Bundesministerium für Arbeit und Soziales im Gemeinsamen Ministerialblatt bekannt gegeben.

Diese TRBa 468 konkretisiert im Rahmen des Anwendungsbereichs die Anforderungen der Biostoffverordnung über Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen. Bei Einhaltung der Technischen Regeln kann der Arbeitgeber insoweit davon ausgehen, dass die entsprechenden Anforderungen der Verordnung erfüllt sind. Wählt der Arbeitgeber eine andere Lösung, muss er damit mindestens die gleiche Sicherheit und den gleichen Gesundheitsschutz für die Beschäftigten erreichen.

Die vorliegende Technische Regel beruht auf der BGI 636 "Sichere Biotechnologie - Zellkulturen" des Fachausschusses "Chemie" der Deutschen Gesetzlichen Unfallversicherung (DGUV). Der Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe hat die grundlegenden Inhalte der BGI 636 "Sichere Biotechnologie - Zellkulturen" in Anwendung des Kooperationsmodells (BArbBl. 6/2003, S. 48) als TRBa in sein Regelwerk übernommen.

1 Anwendungsbereich

Diese TRBa gilt für Tätigkeiten mit Zellkulturen eukaryontischen Ursprungs (ausgenommen Pilze). Sie umfasst die Einstufung von Zellkulturen in die Risikogruppe (siehe dazu auch Nummer 4.1) und bei Anwesenheit von zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffen (z.B. Kontaminanten) die Zuordnung der Tätigkeiten mit diesen Zellkulturen zu einer Schutzstufe. Zugrunde gelegt wird das Schutzstufenkonzept gemäß der Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen ( Biostoffverordnung). Darüber hinaus ist für Tätigkeiten mit Zellkulturen und den nachgewiesenen zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffen im Labor die TRBa 100 "Schutzmaßnahmen für gezielte und nicht gezielte Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen in Laboratorien" [ 1] anzuwenden.

2 Begriffsbestimmungen Zusätzlicher biologischer Arbeitsstoff

Ein in tierischen oder pflanzlichen Zellkulturen vorhandener Mikroorganismus, dessen Erbgut in das Genom der Zellen integriert oder der in die Zelle inkorporiert ist, z.B. als Folge einer Infektion.

Als zusätzlicher biologischer Arbeitsstoff gilt auch ein biologischer Arbeitsstoff, der als Folge einer Verunreinigung aus der Umgebung (Umwelt), aus Medienbestandteilen, während der Isolierung oder im weiteren Arbeitsprozess in ein System oder Medium (z.B. Zellkultur, mikrobiologisches Nährmedium) gelangt ist (Kontaminante).

Zellkultur

In-vitro-Haltung oder -Vermehrung von aus vielzelligen Organismen isolierten vereinzelten Zellen in Nährmedien außerhalb des Spenderorganismus.

• Primärzellkultur
  • Kurzzeitzellkultur
    Zellen, die aus einem Lebewesen entnommen und unmittelbar in ein Kulturgefäß verbracht und nicht weiter passagiert werden.
  • Langzeitzellkultur (finite Zellkultur)
    Zellen, die aus einem Lebewesen entnommen und unmittelbar in ein Kulturgefäß verbracht, weiter passagiert werden und mehrere Monate lebensfähig sind, aber nach einer gewissen Anzahl von Teilungen (meist 40 bis 60) aufgrund von Alterung absterben.
• Sekundärzellkultur (permanente Zellkultur)
  • Zelllinie
    Zellen einer Gewebeart, die sich unter geeigneten Kulturbedingungen unbegrenzt teilen können (immortalisierte Zellen).

Zellkultursammlung

Institution zur Sammlung und Bereitstellung einer größeren Zahl von Zelllinien definierter Herkunft.

Zellbank

Zellen definierter Herkunft, die unter einheitlichen Bedingungen vermehrt, zu einer homogenen Suspension vereinigt, in aliquote Teilmengen abgefüllt, unter definierten Bedingungen eingefroren und gelagert werden.

• Master (Seeding) Cell Bank (Master Stock)
  Kryokonservierte Zellen, die ausschließlich zum Auffüllen der Working Cell Bank bestimmt sind.
• Working Cell Bank (Working Stock)
  Kryokonservierte Zellen, die zur weiteren Bearbeitung bestimmt sind.

Ursprungsorganismus

Vielzelliger eukaryontischer Organismus (ausgenommen Pilze), aus dem die Zellen zur Kultivierung entnommen werden.

Im Übrigen sind in dieser TRBa die Begriffe so verwendet, wie sie im Begriffsglossar zu den Regelwerken der Betriebssicherheitsverordnung (BetrSichV), Biostoffverordnung (BioStoffV) und der Gefahrstoffverordnung (GefStoffV) des ABS, ABAS und AGS bestimmt sind.

3 Allgemeines/Zielsetzung

(1) Die in dieser TRBa unter Nummer 6 aufgeführten Zelllinien mit den dazugehörenden Schutzstufen berücksichtigen den Stand der Wissenschaft bis 08/2011. Weitere Informationen zu Zellkulturen sind im Literaturverzeichnis aufgeführt [ 2].

(2) Die Zuordnung der Tätigkeit mit der Zellkultur zu Schutzstufen erfolgt auf der Grundlage der Risikogruppeneinstufung der Zellkultur und der festgestellten oder nachgewiesenen zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffe. Liegen keine zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffe vor, erfolgt die Zuordnung ausschließlich entsprechend der Risikogruppe der Zellkultur. Die Einstufung der zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffe in Risikogruppen erfolgt gemäß den Kriterien für die Einstufung biologischer Arbeitsstoffe, siehe TRBa 450 "Einstufungskriterien für biologische Arbeitsstoffe" [ 3]. Ausführliche Listen der bisher eingestuften biologischen Arbeitsstoffe finden sich in den TRBa 460 bis 466 [ 4] und unter [ 5] im Literaturverzeichnis.

(3) Für die Zuordnung der Zellkulturen zur Schutzstufe ist die Gefährdungsbeurteilung maßgebend. Sie ist nachfolgend an einigen Beispielen erläutert.

(4) Neu entdeckte und/oder noch nicht bewertete Viren müssen vom Arbeitgeber selbst eingestuft werden.

4 Gefährdungsbeurteilung

4.1 Gefährdungen

(1) Zellkulturen sind biologische Arbeitsstoffe im Sinne der BioStoffV. Zellkulturen werden grundsätzlich in die Risikogruppe 1 eingestuft, da von den kultivierten eukaryontischen Zellen selbst keine Infektionsgefährdung ausgeht, auch nicht von Tumorzellkulturen, wie sich beim langjährigen Umgang gezeigt hat. Daher werden Tätigkeiten mit diesen Zellkulturen gemäß BioStoffV der Schutzstufe 1 zugeordnet (siehe TRBa 100 [ 1]).

(2) Allerdings können Zellkulturen zusätzliche biologische Arbeitsstoffe einer höheren Risikogruppe enthalten, die zu einer höheren Schutzstufe (2 bis 4) führen können:

• Bereits das Ausgangsmaterial für die Primärkultur kann biologische Arbeitsstoffe einer höheren Risikogruppe enthalten, u. U. sogar integriert in das Genom der Zellen.
• Die Zellkulturen können gezielt während eines Experimentes mit biologischen Arbeitsstoffen einer höheren Risikogruppe infiziert werden.
• Die biologischen Arbeitsstoffe können während der vorangegangenen und laufenden Tätigkeiten unbeabsichtigt in die Zellkultur eingeschleppt worden sein.

4.2 Schutzstufenzuordnung

(1) Die Schutzstufe ergibt sich aus einer Gesamtbeurteilung der tätigkeitsbezogenen Gefährdung unter Berücksichtigung von Auftretenswahrscheinlichkeit, Möglichkeit der Abgabe infektiöser Partikel, Übertragungsweg, Menge und Infektiosität der biologischen Arbeitsstoffe und der Expositionssituation. Liegt hinsichtlich dieses zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffes eine mit gezielten Tätigkeiten vergleichbare Gefährdung vor, ist die Schutzstufe entsprechend der Risikogruppe des zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffs zu wählen. Liegt eine verglichen mit gezielten Tätigkeiten geringere Gefährdung vor, kann eine niedrigere Schutzstufe gewählt werden. Zur Vergleichbarkeit von gezielten und nicht gezielten Tätigkeiten siehe TRBa 100 [ 1].

(2) Folgende Informationen sind bei der Bewertung zugrunde zu legen:

A) Wird eine Zellkultur von einer anerkannten* (*anerkannt im Sinne der OECD Best Practice Guidelines for Biological Resource Centres [ 6]) Zellkultursammlung, z.B. in Deutschland dem Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) ¹, bezogen, können bei der Gefährdungsbeurteilung die mitgelieferten Angaben zu Kontaminanten/ Infektionserregern zugrunde gelegt werden. Die Tätigkeiten können dann der Schutzstufe 1 zugeordnet werden, wenn von der Zellkultursammlung keine Infektionen oder Kontaminationen angegeben werden.

B) Wenn die Zellkulturen nachweislich (dokumentiert) infektions- und kontaminationsfrei sind oder die Zellkulturen trotz Infektionen oder Kontaminationen keine für den Menschen pathogenen biologischen Arbeitsstoffe abgeben und somit nach dem Stand der Wissenschaft eine Gefährdung des Beschäftigten ausgeschlossen ist, können die Tätigkeiten in der Schutzstufe 1 durchgeführt werden (siehe auch Punkt D).

C) Tätigkeiten mit einer Zellkultur, von der bekanntermaßen zusätzliche biologische Arbeitsstoffe abgegeben werden, deren Identitäten bekannt sind und die einer Risikogruppe (siehe TRBa 460 bis TRBa 466 [ 4] und unter [ 5] im Literaturverzeichnis) zugeordnet sind, können eine mit gezielten Tätigkeiten vergleichbare Gefährdung aufweisen. Die Tätigkeiten sind dann entsprechend in der der Risikogruppe des zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffes korrespondierenden Schutzstufe durchzuführen (siehe Nummern 4.2 und 4.3, TRBa 100 [ 1]).

D) Humane und nicht humane Primatenzellkulturen (insbesondere Primärzellkulturen), deren Infektions- bzw. Kontaminationsstatus nicht bekannt ist, werden als potenziell infektiös angesehen. Deswegen sind entsprechende Tätigkeiten mindestens unter den Bedingungen der Schutzstufe 2 durchzuführen (siehe Nummer 4.3.2 TRBa 100 [ 1]).

Primäre humane Zellen von klinisch unauffälligen Spendern können in der Schutzstufe 1 gehandhabt werden, wenn durch geeignete Tests die Seronegativität des Spenders für das Humane Immundefizienzvirus (HIV), das Hepatitis-B-Virus (HBV) und das Hepatitis-C-Virus (HCV) nachgewiesen oder durch andere Verfahren gezeigt ist, dass die Zellen frei von diesen Viren sind.

Wenn ein begründeter Verdacht auf das Vorhandensein eines bestimmten biologischen Arbeitsstoffes einer höheren Risikogruppe in den zu verwendenden Primatenzellen besteht, ist auf diesen biologischen Arbeitsstoff zu prüfen oder in der Schutzstufe zu arbeiten, die mit der Risikogruppe des biologischen Arbeitsstoffes korrespondiert.

E) Tätigkeiten mit Zellkulturen aus Tieren (Primaten und Chiroptera ausgenommen) sind der Schutzstufe 1 zuzuordnen, wenn

• die Spendertiere keine Krankheitssymptome zeigen,
• die möglicherweise vorhandenen biologischen Arbeitsstoffe nicht pathogen für den Menschen sind oder
• die Spendertiere aus pathogenfreien Zuchten stammen.

Tätigkeiten mit Zellkulturen aus Ektoparasiten sind der Schutzstufe 1 zuzuordnen, wenn sichergestellt werden kann, dass sie nicht an einem infizierten Wirt parasitiert haben. Gibt es trotzdem einen begründeten Verdacht, dass eine Infektion mit einem humanpathogenen Erreger vorliegt, so sind die Tätigkeiten mindestens der Schutzstufe 2 zuzuordnen.

Primäre Zellen von Chiroptera sind, auch wenn die Tiere keine Krankheitssymptome zeigen, in der Schutzstufe 2 zu handhaben, es sei denn, sie sind nachweislich frei von Tollwutviren und anderen bei Chiroptera vorkommenden humanpathogenen Viren (z.B. Hendravirus, Nipahvirus).

F) Wenn zu einem späteren Zeitpunkt eine Kontamination mit einem zusätzlichen biologischen Arbeitsstoff festgestellt wird, muss dies bei der Gefährdungsbeurteilung berücksichtigt werden.

G) Tätigkeiten mit pflanzlichen Zellen und Zellen, die nicht mit humanpathogenen biologischen Arbeitsstoffen infizierbar sind, sind der Schutzstufe 1 zuzuordnen.

H) Handelt es sich bei den zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffen um solche, die bislang noch nicht eingestuft wurden, muss der Arbeitgeber gemäß § 4 Abs. 2 BioStoffV eine Einstufung nach dem Stand der Wissenschaft vornehmen.

I) Dient die Kultivierung der Zellen der gezielten Anreicherung von anderen biologischen Arbeitsstoffen, dann bestimmt die Risikogruppe des anderen biologischen Arbeitsstoffes die Schutzstufe.

(3) Bei Tätigkeiten mit Zellkulturen sind die Regeln der guten Zellkulturtechnik einzuhalten, um Kontaminationen mit biologischen Arbeitsstoffen höherer Risikogruppen während der Tätigkeit zu vermeiden.

(4) Werden trotzdem Kontaminationen mit biologischen Arbeitsstoffen einer höheren Risikogruppe festgestellt, sind die biologischen Arbeitsstoffe oder die Zellkultur durch geeignete Maßnahmen zu inaktivieren bzw. ist eine erneute Gefährdungsbeurteilung durchzuführen.

(5) Bei der Handhabung von Zellkulturen müssen ggf. weitergehende Maßnahmen zur Qualitätssicherung der Zellkulturen etabliert werden, die über die Forderungen des Arbeitsschutzes hinausgehen.

Hinweis: Bei zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffen müssen ggf. die seuchenrechtlichen Bestimmungen des Infektionsschutz-, Tierseuchen- oder Pflanzenschutzgesetzes beachtet werden. Darüber hinaus sind beim Versand oder Transport kontaminierter Zellkulturen inklusive der Medien die einschlägigen Bestimmungen des Transportrechts (Post, Straßen- und Flugverkehr u. a.) zu beachten.

5 Schutzmaßnahmen: Regeln der guten Zellkulturtechnik

Zum Schutz der Beschäftigten sind die einschlägigen Gesetze, Verordnungen und Regelungen zu beachten. Der Stand der Technik, niedergelegt in der TRBa 100 [ 1] in Verbindung mit Anhang 1 Grundregeln guter mikrobiologischer Technik, ist zu gewährleisten.

Des Weiteren dienen folgende Regeln primär der Vermeidung von mikrobiologischen Kontaminationen und/oder Kreuzkontaminationen der Zellkulturen:

• Die Identität der Zellkulturen muss bekannt sein. Zellkulturen können von Zellkultursammlungen mit anerkannter Identifizierungs- und Charakterisierungseinrichtung, z.B. der DSMZ, bezogen werden, um geprüftes Ausgangsmaterial zu besitzen. Bei Zellkulturen aus anderen Quellen müssen der Ursprung und/oder die Herkunft bekannt und dokumentiert sein.
• Von den Zellkulturen sollten möglichst Master Cell Banks (Master Stocks) und Working Cell Banks (Working Stocks) zur Lagerung in Form von Kryokonservierung (z.B. in flüssigem Stickstoff) hergestellt werden. Dadurch kann jederzeit auf das Originalmaterial zurückgegriffen und die Stabilität der Zellkulturen gewährleistet werden.
• Durch geeignete Prüfungen (z.B. morphologische Beurteilung; Wachstumsverhalten; Iso-Enzym-Muster; Karyotyp-Analyse unter Berücksichtigung charakteristischer chromosomaler Marker; PCR-Analyse definierter und charakteristischer Genabschnitte) muss die Identität regelmäßig gesichert werden. Alternativ ist in regelmäßigen Abständen auf die Working Cell Banks (Working Stocks) zurückzugreifen.
• Zur Vermeidung von Verwechslungen müssen auch gentechnische Veränderungen einer Zellkultur eindeutig zugeordnet und als Subklone gekennzeichnet sein.
• Medien und Lösungen, die im Zusammenhang mit der Kultivierung von Zellen verwendet werden, müssen steril sein. Die Bestandteile der Medien und deren Herkunft müssen bekannt sein. Das bedeutet insbesondere Kenntnisse über mögliche Kontaminationen mit typischen zusätzlichen biologischen Arbeitsstoffen (z.B. fötales Rinderserum, oft kontaminiert mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus [BVDV]) und über die Reinheit der Bestandteile (z.B. Trypsin).
• Tätigkeiten mit humanen oder tierischen Zellkulturen der Schutzstufe 2 sind in mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken Klasse II durchzuführen. Auch in der Schutzstufe 1 werden durch den Einsatz von mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken Klasse II Kontaminationen und damit eine Gefährdung der Beschäftigten bei Tätigkeiten mit humanen und tierischen Zellkulturen vermieden.
• Die Oberflächen von Inkubatoren, Wasserbädern, Zentrifugen, mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken usw. müssen regelmäßig gereinigt und zusätzlich in kürzeren Intervallen Sichtkontrollen auf Verunreinigungen durchgeführt werden (Hygieneplan sinnvoll).
• Grundsätzlich sollten keine Versuchstiere in Zellkulturlaboratorien gehalten werden. Hiervon kann abgewichen werden, wenn es für den Versuchsablauf erforderlich ist, dass Versuchstiere vorübergehend in Zellkulturlaboratorien verbracht werden müssen.
• Um eine Kontamination und eine Verbreitung von Mykoplasmen in längerfristigen Zellkulturen zu vermeiden, sind ein oder mehrere zuverlässige Mykoplasmentests auszuführen; alle vorhandenen und neu eintreffenden Zellkulturen sind einleitend zu testen und in regelmäßigen Abständen (vierteljährlich bei Dauerkulturen oder nach entsprechender Kultivierungszeit bei zwischenzeitlich kryokonservierten Kulturen) zu prüfen; bei Kryokonservierung ist vor dem Einfrieren oder bei einem Kontrollauftauen auf Mykoplasmen zu testen; nicht auf Mykoplasmenkontaminationen getestete oder positiv getestete Zellkulturen, die einer Mykoplasmenbehandlung unterzogen werden, sollten räumlich oder zumindest zeitlich getrennt von nicht kontaminierten Zellkulturen kultiviert und getrennt voneinander gelagert werden.
• Master Cell Banks (Master Stocks) sind im Rahmen eines Kontrollauftauens auf Freiheit von Bakterien, einschließlich Mykoplasmen, Pilzen, zelltypischen Viren (siehe Nummer 4.2 Abs. 2 D) zu testen.
• Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen, insbesondere bei Kryokonservierung und Herstellen von Master Cell Banks (Master Stocks) und Working Cell Banks (Working Stocks) sollte nicht mit mehreren Zellkulturen gleichzeitig unter der Sicherheitswerkbank gearbeitet werden.
• Über die Tätigkeiten mit einer Zellkultur sind schriftliche Aufzeichnungen zu führen, z.B. Laborjournal.

6 Liste der Zelllinien mit Zuordnung zur Schutzstufe

Vorbemerkungen

(1) Die Liste der Zelllinien umfasst ausgewählte Zelllinien der American type Culture Collection (ATCC), des Leibniz-Instituts DSMZ und der Zellkultursammlung des Friedrich-Loeffler-Instituts, den Ursprungsorganismus, den zusätzlichen biologischen Arbeitsstoff und die Schutzstufe, in der die Tätigkeiten durchgeführt werden müssen. Die Auflistung berücksichtigt auch die von der Zentralen Kommission für die biologische Sicherheit (ZKBS) eingestuften Zelllinien. Die Liste erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

(2) Mit zusätzlichem biologischen Arbeitsstoff werden diejenigen biologischen Arbeitsstoffe bezeichnet, deren Erbmaterial in der Zelllinie in das Genom integriert ist oder die in die Zelle inkorporiert sind. Für die Zuordnung der Tätigkeiten mit einer Zelllinie zur Schutzstufe ist entscheidend, ob der zusätzliche biologische Arbeitsstoff abgegeben, vermehrt oder exprimiert wird und ob der biologische Arbeitsstoff infektiös ist. Handelt es sich bei dem zusätzlichen biologischen Arbeitsstoff um ein Tierpathogen, sind aus tierseuchenrechtlicher Sicht Sicherheitsmaßnahmen erforderlich, die ein Entweichen in die äußere Umgebung oder in andere Arbeitsbereiche minimieren bzw. verhindern.

(3) Bei bestimmten biologischen Arbeitsstoffen, die in die Risikogruppe 3 eingestuft und in der Liste mit zwei Sternchen (**) versehen wurden, ist das Infektionsrisiko für Beschäftigte begrenzt, da eine Infizierung über den Luftweg normalerweise nicht erfolgen kann. Diese biologischen Arbeitsstoffe wurden inzwischen einer Prüfung daraufhin unterzogen, ob und in welchem Umfang auf bestimmte Sicherheitsmaßnahmen verzichtet werden kann. Informationen über diese Organismen-spezifischen Sicherheitsmaßnahmen enthält die TRBa 100 [ 1].

(4) Bei Einstufungsfragen oder bei Fragen der Zuordnung zur Schutzstufe steht der Unterausschuss 3 "Einstufung" des ABAS ² beratend zur Verfügung.

(5) Für Zelllinien existiert keine einheitliche oder standardisierte Nomenklatur, so dass Zellliniennamen in der Literatur in unterschiedlicher Schreibweise erscheinen können. Dies bezieht sich sowohl auf Groß- und Kleinschreibung, als auch auf die Verwendung von Sonderzeichen (Bindestrich, Schrägstrich, Leerzeichen, griechische Buchstaben), Kürzungen (z.B. HEK-293 und 293) und Synonyme (z.B. Jiyoye, Jijoye, P2003, P-J-3). In der folgenden Liste entsprechen die Zellliniennamen den Benennungen der namhaften Zellkultursammlungen.