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Häufig durchgeführten gentechnischen Arbeiten mit den zugrunde liegenden Kriterien der Vergleichbarkeit:
Gentechnische Arbeiten mit dem Sindbis-Virus- und dem Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
- Allgemeine Stellungnahme der Zentralen Komission für Biologische Sicherheit (ZKBS) -

Fassung vom Oktober 2004
(BAnz. Nr. 116a vom 24.06.2005 S. 4)

1 Das Sindbis-Virus- und das Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem

1.1 Allgemeine Einführung SIN und SFV

Das Sindbis-Virus (SIN) sowie das Semliki-Forest-Virus (SFV) gehören zur Familie der Togaviridae, Genus Alphavirus. Sie verfügen über ein ikosaedrisches Nukleokapsid, welches eine einzelsträngige lineare RNa positiver Polarität als Genom enthält und welches von einer Lipid-Hülle umgeben ist, in der virale Hüllproteine eingebettet sind. Die Viren sind weit verbreitet und werden von Mücken übertragen, SIN von der Gattung Aedes, SFV von der Gattung Culex. SIN kann beim Menschen eine fieberhafte Erkrankung mit Ausschlag und Arthritis hervorrufen, SFV kann beim Menschen ebenfalls eine fieberhafte Erkrankung hervorrufen [1, 2]. Das ursprüngliche SFV-Isolat L10 ist neurovirulent für Mäuse, das SFV-Isolat A7 hingegen ist avirulent [1, 21. Generell gelten diese Viren als schwach pathogen, aber es wurde auch von einem Todesfall berichtet, der durch eine Laborinfektion mit SFV verursacht wurde [3]. In vitro infizieren die Viren ein breites Wirtsspektrum, welches Zellen von Insekten, Vögeln und Säugern umfasst. Vertebratenzellen werden lytisch infiziert, in Insektenzellen verläuft die Infektion in der Regel persistent [1]. Gemäß Bekanntmachung nach § 5 Absatz 6 GenTSV sind SIN und SFV der Risikogruppe 2 zugeordnet.

Bei den viralen Genomen handelt es sich um (+)-Strang-RNA. Sie weisen am 5'-Ende eine CAP-Struktur auf, sind am 3'-Ende polyadenyliert und haben ohne die terminalen Strukturen eine Länge von 11703 nt (49S RNA) bei SIN und 11442 nt (42S RNA) bei SFV. Die genomischen RNAs enthalten zwei offene Leserahmen, einen für die Nichtstrukturproteine und einen für die Strukturproteine. An den Termini sowie zwischen den beiden Leserahmen befinden sich untranslatierte Nukleotidsequenzen (UT), die für die Replikation und Translation essenziell sind. Das Verpackungssignal ψ liegt innerhalb des Leserahmens der Nichtstrukturproteine (Abb. 1) [1, 4, 5]. Zwischen den beiden Leserahmen befindet sich der interne Promotor (subgenomischer Promotor, P_sg oder 26SPromotor) der (-)-Strang-RNA.

Abbildung 1: Genomkarte von SIN und SFV

m⁷GpppA: Cap-Struktur; ψ: Verpackungssignal; nsP1-nsP4: Nichtstrukturproteine;

P_sg: Lage des subgenomischen Promotors; C: Kapsidprotein; E1, E2, E3, 6K: Glykoproteine; Poly(A): Polyadenylierung; UT: untranslatierte Region.

SIN- und SFV-Replikationszyklus

Nach Infektion einer Zelle dient das virale Genom .direkt als mRNA. Von ihr werden zuerst die viralen Nichtstrukturproteine nsP1-4 als Polyprotein translatiert, welches über die Proteaseaktivität von nsP2 zu den einzelnen Nichtstrukturproteinen nsP1, nsP2, nsP3 und nsP4 prozessiert wird, die dann zur Replikase aggregieren und das Genom in komplementäre (-)-Strang-RNa umschreiben. Die Nichtstrukturproteine zeigen folgende Funktionen: Methyltransferase bei nsP1, Protease bei nsP2, nsP3 ist ein Phosphoprotein mit noch ungeklärter Funktion und nsP4 wahrscheinlich die Polymerase. Der (-)-Strang dient als Template für die Herstellung genomischer "full-length" RNa sowie über den internen subgenomischen Promotor auch für die Herstellung der subgenomischen 26S RNA, die ebenfalls mit CAP-Struktur und Polyadenylierung versehen wird [1].

Auch die subgenomische RNa wird zunächst in ein Polyprotein translatiert, welches nach Proteolyse schließlich zum Kapsidprotein C, den Glykoproteinen El, E2 und E3 sowie dem Protein 6K prozessiert wird. C ist eine Autoprotease, die sich selbst vom Rest der Strukturproteine abspaltet und das Verpackungssignal Ni, welches auf dem SIN-Genom innerhalb des nsP1-Leserahmens [4] und auf dem SFV-Genom innerhalb des nsP2-Leserahmens [5] liegt, erkennt und über diese Bindung genomische RNa zum Nukleokapsid verpackt. E3 ist ein Leader-Protein und bleibt mit E2 zunächst als Vorläuferprotein (PE2 oder p62) verbunden, das erst beim Zusammenbau des neuen Viruspartikels von einer zellulären Protease intrazellulär gespalten wird. Im Gegensatz zu SFV wird in der viralen Hülle von SIN kein E3 gefunden, jedoch sind beide Viren in der Lage, auch das ungespaltene Vorläuferprotein in die Virushülle einzubauen, seine proteolytische Spaltung ist aber Voraussetzung für die weitere Infektiosität [6, 7]. E2 interagiert beim viralen Zusammenbau mit dem Nukleokapsid und bildet zusammen mit El Heterodimere aus, wovon jeweils drei einen "Spike" in der viralen Hülle formen. 6K ist ein Leader-Protein und für den Zusammenbau des Viruspartikels von Bedeutung. E1 ist zu Beginn der Infektion für die Fusion der viralen Membran mit der Wirtszellmembran verantwortlich [1].

Die Replikation der viralen RNAs findet im Zytoplasma statt. Die neuen Viruspartikel werden von der infizierten Zelle durch Knospung abgegeben [1].

1.2 Gentransfer mithilfe SIN- und SFV-abgeleiteter Vektoren

Grundsätzlich werden drei typen von SIN- oder SFV-abgeleiteten Vektor-Systemen unterschieden.

• Die Vektoren verfügen lediglich über cis-regulatorische Nukleotid-Sequenzen für die Replikation sowie einen Promotor für die Expression des heterologen Gens. Sie benötigen über eine Helferfunktion die Nichtstrukturproteine für die Replikation der RNa und die Expression des heterologen Gens sowie die Strukturproteine zur Erzeugung viraler Partikel.