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B.40. 1 Methode

B.40. 1.1 Einleitung

Zwei In-vitro-Tests zur Prüfung auf hautätzende Wirkung - der TER-Test (TER = transcutaneous electrical resistance) an Rattenhaut und ein Test mit einem menschlichen Hautmodell - wurden vom Europäischen Zentrum zur Validierung von Alternativmethoden (ECVAM, Gemeinsame Forschungsstelle der Europäischen Kommission) (1) (2) (3) als wissenschaftlich validierte Tests anerkannt. Die Validierungsstudie des ECVAM hat gezeigt, daß beide Tests in der Lage sind, zuverlässig zwischen hautätzenden Stoffen und solchen, die diese Eigenschaften nicht aufweisen, zu unterscheiden. Darüber hinaus ermöglichte der Test auf der Grundlage eines Modells der menschlichen Haut eine korrekte Klassifizierung unterschiedlicher ätzender Wirkungsstärken (bekannte Stoffe, die zu schweren Verätzungen führen, R35, und sonstige hautätzende Stoffe, R34) (2). Beide Testmethoden werden beschrieben; die Wahl des geeigneten Test hängt von den spezifischen Anforderungen und Präferenzen der Anwender ab.

Siehe auch " Allgemeine Einleitung" Teil B.

B.40. 1.2 Begriffsbestimmung

Hautätzende Wirkung: irreversible Schädigung des Hautgewebes nach Anwendung eines Testmaterials.

B.40. 1.3 Referenzstoffe

Nicht spezifiziert, siehe jedoch Ziffern 1.5.3.4 und 1.7.2.3.

B.40. 1.4 Prinzip der Testmethode - TER-Test an Rattenhaut

Die Testsubstanz wird bis zu 24 Stunden topisch auf die Epidermis von Hautstücken aus dem Fell von Jungratten appliziert, die vorher tierschutzgerecht getötet wurden. Hautätzende Stoffe werden dabei durch ihre Fähigkeit, die Unversehrtheit der Hornhaut und ihrer Schutzfunktion zu zerstören, identifiziert, und zwar, indem die Verringerung des inhärenten transkutanen Hautwiderstands (TER) unter einen Schwellenwert (5 kΩ) gemessen wird (4) (5). Reizende und nicht-reizende Stoffe bewirken keinen Rückgang des TER unter den Schwellenwert. Bei Testung von oberflächenaktiven Stoffen und neutralen organischen Stoffen (Begriffsbestimmung s. (6)) kann das Testverfahren durch einen Farbbindungsschritt ergänzt werden, um die Anzahl der speziell mit diesen Chemikalientypen erzielten falsch positiven Ergebnisse zu reduzieren (2) (7).

B.40. 1.5 Beschreibung der Testmethode - TER-Test an Rattenhaut

B.40. 1.5.1 Versuchstiere

Für die Herstellung der Hautstücke sind Jungratten im Alter von 20-23 Tagen (Wistar oder vergleichbarer Stamm) erforderlich. Das Fell am Rücken und an den Flanken wird mit einem für Kleintiere geeigneten Instrument sorgfältig geschoren. Die Tiere werden dann mit vorsichtigen Wischbewegungen gewaschen, wobei diese Fläche in eine Antibiotikalösung getaucht werden (die Lösung enthält z.B. Streptomycin, Penicillin, Chloramphenicol und Amphotericin in Konzentrationen, die ein bakterielles Wachstum verhindern). Die Tiere werden dann am dritten oder vierten Tag nach dem ersten Waschvorgang erneut mit der Antibiotikalösung gewaschen und innerhalb von drei Tagen verwendet (die Tiere dürfen für die Hauptpräparationen nicht älter als 31 Tage sein).

B.40. 1.5.2 Herstellung der Hautstücke

Die Versuchstiere werden tierschutzgerecht getötet. Sodann wird die Rückenhaut jedes Tieres entfernt, und von übermäßigem Fett befreit, das von der Haut sorgfältig abgeschält wird. Die Haut wird so über das Ende eines PTFE (Polytetrafluorethylen)- Rohres gelegt, daß die Epidermisoberfläche auf dem Ende des Rohres aufliegt. Zur Fixierung des Hautstücks wird ein "O"-Ring aus Gummi straff über das Rohrende gezogen, und überflüssiges Hautgewebe wird abgeschnitten. Die Abmessungen des Rohrs und des "O"-Rings sind in Abbildung 1 angegeben. Der "O"-Ring wird sodann mit gereinigter Naturvaseline zum Ende des PTFE-Rohrs hin gründlich abgedichtet. Das Rohr wird durch eine Federklemme in einer Rezeptorkammer gehalten, die Magnesiumsulfatlösung (154 mM) enthält (Abbildung 2).

B.40. 1.5.3 Testverfahren

B.40. 1.5.3.1 Aufbringung der Testsubstanzen

Flüssige Testsubstanzen (150 µl) werden auf die Epidermisoberfläche innerhalb des Rohrs gebracht (Abbildung 2). Zur Testung von Feststoffen wird eine ausreichende Menge auf das Hautstück aufgebracht, wobei darauf zu achten ist, daß die gesamte Oberfläche der Epidermis bedeckt ist. Sodann wird entionisiertes Wasser (150 µl) auf den Feststoff gebracht und das Rohr zur Verteilung des Feststoffes leicht bewegt. Die Testsubstanzen sollten mit der Haut optimal in Kontakt kommen. Bei einigen Feststoffen kann dies durch Erwärmung bis zu 30 °C zwecks Schmelzen oder durch Zermahlen zu einem Granulat oder Pulver erreicht werden. Für jede Testsubstanz werden drei Hautstücke verwendet. Die Testsubstanz wird 24 Stunden lang aufgebracht (siehe auch 1.5.3.4), sodann durch Waschen unter fließendem Wasser bei maximal 30 °C abgewaschen und vollständig entfernt. Zur leichteren Entfernung von evtl. im Rohr fest gewordenen Testsubstanzen kann ein Wasserstrahl von ca. 30 °C eingesetzt werden.

B.40. 1.5.3.2 TER - Messungen

Der TER wird mit einer Wheastonschen-Wechselstrom-Meßbrücke mit niedriger Spannung gemessen (z.B. AIM 401 oder 6401 oder gleichwertige Meßbrücke). Vor der Messung des elektrischen Widerstands wird die Oberflächenspannung der Haut durch Auftrag von 70 %igem Äthanol verringert, wobei die Menge ausreichen soll, um die gesamte Epidermis zu bedecken. Nach einigen Sekunden wird das Äthanol durch Kippen des Rohrs entfernt, und das Gewebe wird durch Hinzufügen von 3 ml Magnesiumsulfatlösung (154 mM) befeuchtet. Zur Messung des Widerstands in kΩ /Hautstück werden die Elektroden der Meßbrücke beidseitig des Hautstücks plaziert (Abbildung 2). Die Gesamtabmessungen der Elektroden und die Länge der Elektroden unterhalb der Abgreifklemmen sind in Abbildung 1 angegeben. Die Abgreifklemme der inneren (dicken) Elektrode liegt während der Widerstandsmessung oben auf dem PTFE-Rohr auf, um sicherzustellen, daß stets eine gleichbleibende Elektrodenlänge in die Magnesiumsulfatlösung getaucht bleibt. Die äußere (dünne) Elektrode befindet sich innerhalb der Rezeptorkammer an deren Boden. Der Abstand zwischen dem unteren Ende der Federklemme und dem unteren Ende des PTFE-Rohrs konstant (Abbildung 1), da dieser Abstand den erzielten Widerstandswert beeinflußt.

Anmerkung: Wenn der gemessene Widerstandswert über 20 kΩ liegt, so kann dies an einem Rest der Testsubstanz liegen, der die Epidermisoberfläche des Hautstücks bedeckt. Zur Entfernung dieser Schicht kann versucht werden, das mit einem durch Gummihandschuh geschützten Daumen verschlossene PTFE-Rohr ca. 10 Sekunden zu schütteln. Die Magnesiumsulfatlösung wird dann verworfen, und die Widerstandsmessung wird mit frischem Magesiumsulfat wiederholt.

Die TER-Ergebnisse (Mittelwerte) einer Testsubstanz werden nur angenommen, sofern die Ergebnisse der gleichzeitig getesteten Positivkontrollen und Negativkontrollen innerhalb definierter Akzeptanzgrenzen liegen. Für die beschriebene Methodik und Versuchsanordnung werden folgende Kontrollsubstanzen und dazugehörige TER-Akzeptanzbereiche vorgeschlagen:

B.40. 1.5.3.3 Testvariante für oberflächenaktive Stoffe und neutrale organische Stoffe

Wenn die TER-Werte bei oberflächenaktiven oder neutralen organischen Testsubstanzen 5 kΩ oder weniger betragen, kann eine Beurteilung der Penetration eines Farbstoffes an den Geweben durchgeführt werden. Dieses Verfahren zeigt an, ob die Ergebnisse falsch positiv sind (2).

B.40. 1.5.3.3.1 Anwendung und Entfernung von Sulforhodamine B-Farbstoff

Nach der Applikation der Testsubstanz zur Bestimmung des TER werden 150 µl Sulforhodamin B-Farbstoff in 10 %iger (w/v) Verdünnung in destilliertem Wasser für zwei Stunden topisch auf jedes Hautstück aufgebracht. Die Hautstücke werden sodann unter fließendem Wasser von höchstens Raumtemperatur etwa 10 Sekunden lang mit einem Wasserstrahl gewaschen, um überschüssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Jedes Hautstück wird sorgfältig vom PTFE-Rohr entfernt und in ein geeignetes verschließbares Gefäß (z.B. ein 20-ml-Scintillationsfläschchen) mit entionisiertem Wasser (8 ml) gebracht. Die Fläschchen werden 5 Minuten lang vorsichtig geschüttelt, um überschüssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Nach Wiederholung des Spülvorgangs werden die Hautstücke in Fläschchen mit 5 ml 30 %igem (w/v) Natriumdiodecylsufat (SDS) in destilliertem Wasser überführt und über Nacht bei 60 °C im Brutschrank aufbewahrt. Nach der Inkubation wird jedes Hautstück entfernt und verworfen, und die verbleibende Lösung wird 8 Minuten lang bei 21 °C zentrifugiert (relative Zentrifugalkraft ~ 175). Eine 1-ml-Probe des oberflächenaktiven Stoffs wird sodann 1:5 (v/v) [d. h. 1 ml + 4 ml] mit 30 %iger (w/v) SDS-Lösung in destilliertem Wasser verdünnt. Die optische Dichte (OD) der Lösung wird bei ca. 565 nm gemessen.

B.40. 1.5.3.3.2 Berechnung des Farbgehalts

Der Gehalt an Sulforhodamin B-Farbstoff je Hautstück wird mittels der OD-Werte berechnet (molarer Extintionskoeffizient von Sulforhodamin B bei 565 nm = 8,7 × 10⁴, Molekulargewicht = 580). Der Gehalt an Sulforhodamin B wird für jedes der drei Hautstücke bestimmt und dann der Mittelwert berechnet. Die erhaltenen Mittelwerte der Farbbindung einer Testsubstanz werden nur angenommen, sofern die Ergebnisse der gleichzeitig getesteten Kontrollen innerhalb definierter Akzeptanzgrenzen liegen. Für die beschriebene Methodik und Versuchsanordnung werden folgende Akzeptanzbereiche vorgeschlagen:

B.40. 1.5.3.4 Zusatzinformation

Testsubstanzen können auf die Hautstücke auch für kürzere Zeiträume (z.B. 2 Stunden) aufgebracht werden, um Materialien zu identifizieren, die hochgradig ätzend sind. In der Validierungsstudie zeigte sich jedoch, daß der TER-Test das ätzende Potential mehrerer Testchemikalien nach zweistündiger Einwirkung auf die Hautstücke (2) überbewertet, wenngleich er eine korrekte Identifizierung ätzender und nicht ätzender Stoffe nach 24stündiger Einwirkung gestattet.

Die Eigenschaften und Abmessungen der Versuchsanlage und die angewandte Testmethode können die TER-Werte beeinflussen. Der Schwellenwert von 5 kΩ zur Vorhersage hautätzender Eigenschaften eines Stoffes wurde aufgrund von Daten ermittelt, die mit den hier beschriebenen spezifischen Geräten und Verfahren erzielt wurden. Im Falle einer signifikanten Änderung der Testbedingungen können andere Schwellen- und Kontrollwerte gelten. In diesem Fall empfiehlt es sich, die Methodik und die Widerstandsschwellenwerte durch Austestung einer Reihe von Referenzstandards zu kalibrieren, die aus den in der Validierungsstudie (3) verwendeten Chemikalien auszuwählen sind.

B.40. 1.6 Prinzip der Testmethode - Test mit menschlichem Hautmodell

Die Testsubstanz wird bis zu 4 Stunden topisch auf ein dreidimensionales Modell menschlicher Haut aufgebracht, das eine rekonstruierte Epidermis mit funktionaler Hornhaut besitzt. Ätzende Materialien werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, eine Abnahme der Viabilität (Lebensfähigkeit) der Zellen (dies kann beispielsweise durch Anwendung des MTT-Reduktionstests festgestellt werden) unter festgelegte Schwellenwerte bei einer spezifischen Expositionsdauer zu bewirken. Dieses Testprinzip basiert auf der Hypothese, daß ätzende Chemikalien in der Lage sind, (durch Diffusion oder Erosion) die Hornhaut zu durchdringen und darüber hinaus ausreichend zytotoxisch sind, um in den darunterliegenden Zellschichten das Absterben von Zellen zu bewirken.

B.40. 1.7 Beschreibung der Testmethode - Test mit menschlichem Hautmodell

B.40. 1.7.1 Modelle menschlicher Haut

Modelle rekonstruierter menschlicher Haut können aus unterschiedlichen Quellen stammen, müssen jedoch bestimmten Kriterien genügen. Das Modell muß eine funktionale Hornhaut mit einer darunter liegenden Schicht lebender Zellen aufweisen. Die Barrierefunktion der Hornhaut muß angemessen sein. Dies kann durch Nachweis der Widerstandsfähigkeit des Modells gegenüber Substanzen aufgezeigt werden, von denen bekannt ist, daß sie Zellen gegenüber toxisch sind, jedoch normalerweise die Hornhaut nicht durchdringen. Bei Einhaltung definierter Versuchsbedingungen muß das Modell nachweislich reproduzierbare Ergebnisse erbringen.

Die Viabilität der vitalen Zellen des Hautmodells muß hinreichend groß sein, um gut zwischen Positivkontrollen und Negativkontrollen unterscheiden zu können. Die Viabilität der Zellen (z.B. bestimmt durch MTT-Reduktion und gemessen als OD-Wert) nach Exposition mit der Negativkontrolle muß innerhalb der für das jeweilige Modell definierten Akzeptanzgrenzen liegen. Ebenso müssen die Viabilitätswerte nach Exposition mit der Positivkontrolle (ausgedrückt in % der Viabilität der Negativkontrolle) innerhalb der definierten Akzeptanzgrenzen liegen. Es ist unbedingt erforderlich, daß das eingesetzte Modell zur Vorhersage hautätzender Eigenschaften (Prädiktionsmodell) internationalen Validierungsstandards entspricht (2).

B.40. 1.7.2 Testverfahren

B.40. 1.7.2.1 Anwendung der Testsubstanzen

Bei flüssigen Materialien muß genügend Testsubstanz appliziert werden, damit die Hautoberfläche ganz bedeckt ist (mindestes 25 µl/cm²). Bei der Prüfung von Feststoffen muß soviel Testsubstanz aufgebracht werden, daß die Haut ganz bedeckt ist. Diese sind dann anzufeuchten, damit ein guter Kontakt mit der Haut gewährleistet ist. Falls erforderlich sollten Feststoffe vor der Anwendung zu Pulver zermahlen werden. Die Methodik der Applikation muß nachweislich auf ein breites Spektrum unterschiedlicher Chemikalientypen (2) anwendbar sein. Zum Ende der Expositionszeit muß das Testmaterial sorgfältig mit einer gepufferten isotonischen Salzlösung von der Hautoberfläche abgewaschen werden.

B.40. 1.7.2.2 Messung der Zellviabilität

Jede validierte quantitative Methode kann zur Messung der Zellviabilität angewendet werden. Die am häufigsten angewandte Methode ist die MTT-Reduktion, die nachweislich in verschiedenen Laboratorien genaue und reproduzierbare Ergebnisse erbracht hat (2). Das Hautstück wird 3 Stunden lang in eine MTT-Lösung von 0,3 mg/ml bei 20-28 °C gelegt. Der blaue Formazan-Niederschlag wird sodann extrahiert (Lösemittelextraktion), und die Formazankonzentration wird durch Bestimmung des OD-Werts bei einer Wellenlänge zwischen 545 und 595 nm gemessen.

B.40. 1.7.2.3 Zusatzinformation

Das verwendete Hautmodell und das genaue Protokoll der Expositionszeit, der Waschverfahren usw. haben einen großen Einfluß auf die erzielten Ergebnisse der Zellviabilität. Es wird daher empfohlen, Methodik und Modell zur Vorhersage hautätzender Eigenschaften durch Austestung einer Reihe von Referenzstandards zu kalibrieren, die aus den in der ECVAM-Validierungsstudie (3) verwendeten Chemikalien auszuwählen sind. Es ist von entscheidender Bedeutung, daß sich die angewandte Methodik nachweislich reproduzierbar zeigt, d. h. für ein breites Spektrum von Chemikalien sowohl innerhalb eines Laboratoriums, als auch zwischen verschiedenen Laboratorien im Einklang mit internationalen Standards vergleichbare Ergebnisse liefert. Die Methode sollte mindestens den bereits publizierten Kriterien für die wissenschaftliche Validität (2) entsprechen, und die Ergebnisse einer solchen Validierungsstudie müssen in einer unabhängig referierten wissenschaftlichen Zeitschrift veröffentlicht werden.

B.40. 2 Daten

B.40. 2.1 Darlegung der Ergebnisse

B.40. 2.1.1 TER-Test an Rattenhaut

Die Widerstandswerte (kΩ ) für die Testsubstanz, Positivkontrolle, Negativkontrolle sowie alle Standard-Referenzchemikalien, einschließlich der Einzeldaten von Mehrfachbestimmungen und Wiederholungstests, der Mittelwerte und der davon abgeleiteten Klassifizierung, sollten in Tabellenform aufgeführt werden.

B.40. 2.1.2 Test mit menschlichem Hautmodell

Die OD-Werte und die relativen Werte der Zellviabilität für die Testsubstanz, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle sowie für alle Standard-Referenzchemikalien, einschließlich der Einzeldaten von Mehrfachbestimmungen und Wiederholungstests, der Mittelwerte und der davon abgeleiteten Klassifizierung, sollten in Tabellenform aufgeführt werden.

B.40. 2.2 Bewertung und Interpretation der Ergebnisse

B.40. 2.2.1 TER-Test an Rattenhaut

Wenn der für die Testsubstanz erzielte mittlere TER-Wert über 5 kΩ liegt, ist die Substanz nicht ätzend. Beträgt der TER-Wert jedoch 5 kΩ oder weniger, und handelt es sich bei der Testsubstanz nicht um einen oberflächenaktiven oder einen neutralen organischen Stoff, so ist die Testsubstanz ätzend.

Bei oberflächenaktiven oder neutralen organischen Stoffen, die TER-Werte von über 5 kΩ oder weniger ergeben, kann ein Test auf Farbstoffpenetration durchgeführt werden. Ist der mittlere Farbgehalt des Hautstücks gleich groß oder größer als der gleichzeitig bestimmte mittlere Farbgehalt des Hautstücks der 36 %igen HCl-Positiv-Kontrolle, so ist die Testsubstanz falsch positiv und daher nicht ätzend.

B.40. 2.2.2 Test mit menschlichem Hautmodell

Der gemessene OD-Wert der Negativkontrolle wird mit einer 100 %igen Zellviabilität gleichgesetzt. Folglich können die für jede Testprobe erzielten OD-Werte zur Berechnung einer prozentualen Zellviabilität im Vergleich zur Negativkontrolle herangezogen werden. Der Schwellenwert der prozentualen Zellviabilität, der zur Unterscheidung zwischen ätzenden und nicht ätzenden Testsubstanzen verwendet wird (oder die Schwellenwerte zur Differenzierung des ätzenden Potentials in weitere Unterklassen), müssen in einem Prädiktionsmodell vor der Validierung der Methode klar definiert sein, und die anschließende Validierungsstudie muß die Richtigkeit dieser Werte bestätigen (2).

B.40. 3 Berichterstattung

Test-Bericht

Der Prüfbericht muß mindestens folgende Informationen enthalten:

Testsubstanz:

• Kenndaten, physikalische Eigenschaften und gegebenenfalls physikalisch-chemische Eigenschaften. Ähnliche Informationen sollten für Referenzsubstanzen vorgelegt werden, sofern sie verwendet werden.

Testbedingungen:

• Einzelheiten der angewandten Testmethode;
• Beschreibung und Begründung jeglicher Änderungen.

Ergebnisse:

• Tabellarische Anordnung der Widerstandswerte (TER-Test) oder der prozentualen Zellviabilität (Test mit menschlichem Hautmodell) für die Testsubstanz, die Positivkontrollen und Negativkontrollen sowie für alle Standard-Referenzchemikalien, einschließlich der Einzeldaten von Mehrfachbestimmungen und Wiederholungsversuchen sowie deren Mittelwerte;
• Beschreibung aller sonstigen beobachteten Wirkungen.

Diskussion der Ergebnisse.

Schlußfolgerungen.

B.40. 4 Literatur

(1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLa 26, S. 275-280.

(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, S. 483-524.

(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. & Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, S. 471-482.

(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, S. 507-512.

(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, S. 191-194.

(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLa 26, S. 709-720.

(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. & Balls, M. (1995), a prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLa 23, S. 219-255.

Abbildung 1

Abbildung 2

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