umwelt-online: Bestimmung der Toxizität

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B.18. 1. Methode

B.18. 1.1. Einleitung

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B.

B.18. 1.2. Definitionen

Siehe allgemeine Einleitung - Teil B; B

B.18. 1.3. Bezugssubstanzen
Keine.

B.18. 1.4. Prinzip der Methode

Mit dem Test zur unplanmäßigen DNS-Synthese (UDS)-Test wird die DNS-Reparatursynthese nach Ausschneiden und Entfernen des Abschnittes eines DNS-Stranges gemessen, in dem sich die durch chemische und physikalische Agenzien induzierte Schädigung befindet. Der UDS-Test eignet sich zur Ermittlung der "long patch"-Repararur. Die "short patch"-Reparatur oder Insertion einzelner Nukleotidbasen läßt sich damit nicht oder nur mit einem sehr geringen Empfindlichkeitsgrad feststellen. Der Test beruht auf dem Einbau von tritiummarkiertem Thymidin (³H-TdR) in die DNS von Säugetierzellen, die sich außerhalb der S-Phase des Zellzyklus befinden. Die³H-TdR-Aufnahme läßt sich durch Autoradiographie oder eine Flüssigkeitsszintillationszählung (LSC = Liquid Scintillation Counting) der DNS behandelter Zellen bestimmen. Säugetierzellen in Kultur werden, sofern es sich nicht um primäre Rattenhepatozyten handelt, mit der Prüfsubstanz mit oder ohne Zusatz eines exogenen Stoffwechselaktivierungssystems behandelt. Die UDS läßt sich auch in in vivo-Systemen messen.

B.18. 1.5. Qualitätskriterien

Keine.

B.18. 1.6. Beschreibung der Methode

Vorbereitung

Die Prüfsubstanzen und die Kontroll- oder Bezugssubstanzen sollten in Mediem oder in geeigneten Lösungsmitteln gelöst oder suspendiert werden. Die endgültige Lösungsmittelkonzentration darf die Überlebensrate der Zellen nicht beeinträchtigen.

In diesem Versuch können primäre Kulturen von Rattenhepatozyten, menschlichen Lymphozyten oder etablierten Zellinien (z.B. menschliche diploide Fibroblasten) verwendet werden.

Die Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechselaktivierungssystems erfolgen.

Versuchsbedingungen

Anzahl der Kulturen

Für jeden experimentellen Punkt werden mindestens zwei Zellkulturen für die Autoradiographie verwendet und mindestens sechs Zellkulturen (wenn es wissenschaftlich begründbar ist, können weniger verwendet werden) für das LSC-Verfahren.

Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen

Für jeden Versuch sind gleichzeitig Positiv- und (unbehandelte und/oder Lösungsmittel) Negativkontrollen mit oder ohne Zusatz eines Metabolisierungssystems anzulegen.

Beispiele für die Positivkontrollen für den Rattenhepatozytenversuch sind: 7,12-Dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA) oder 2-Acetylaminofluoren (2-AAF). Werden etablierte Zellinien verwendet, kann 4-Nitochinolin-N-oxid (4-NAO) als Positivkontrolle für Autoradiographie- und LSC-Versuche ohne Stoffwechselaktivierung dienen. Ein Beispiel für eine Positivkontrolle bei Verwendung von Stoffwechselakrivierungssystemen ist N-Dimethylnitrosamin.

Konzentrationen

Es sind mehrere unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz zu verwenden. Die höchste Konzentration sollte zytotoxisch wirken. Relativ wasserunlösliche Verbindungen sind bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen Substanzen ist die höchste Konzentration von Fall zu Fall festzulegen.

Zellen

Die Kulturen sind unter geeigneten Bedingungen (Wachstumsmedien, CO₂-Konzentration, Temperatur und Feuchtigkeit) zu halten. Etablierte Zellinien sind periodisch auf Mycoplasma-Verunreinigung zu überprüfen. Weiterhin ist eine periodische Überprüfung der Zellen auf Karyotypstabilität ratsam.

Stoffwechselaktivierung

Bei primären Hepatozytenkulturen wird kein exogenes Stoffwechselaktivierungssystem verwendet.

Die Behandlung etablierter Zellinien und Lymphozyten mit der Prüfsubstanz erfolgt sowohl mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten exogenen Stoffwechselaktivierungssystems.

Versuchsdurchführung

Vorbereitung der Kulturen

Etablierte Zellinien werden aus Stammkulturen gewonnen (z.B. durch Trypsinierung bzw. Abschütteln), in Kulturgefäße in angemessener Zelldichte überimpft und bei 37 °C inkubiert.

Kurzzeitkulturen von Rattenhepatozyten werden dadurch angelegt, daß man es frisch gewonnenen Hepatozyten ermöglicht, sich in einem geeigneten Medium an die Wachstumsfläche festzuheften.

Kulturen von menschlichen Lymphozyten werden mit geeigneten Verfahren angelegt.

Behandlung der Kulturen mit der Prüfsubstanz

Primäre Rattenhepatozyten

Frisch isolierte Rattenhepatozyten werden in einem³H-TdR enthaltenden Medium während eines angemessenen Zeitraums mit der Prüfsubstanz behandelt. Nach Ende der Behandlung wird das Medium entfernt, die Zellen werden gewaschen, fixiert und getrocknet. Die Objektträger werden in Autoradiographieemulsion getaucht (alternativ dazu können "stripping"-Filme verwendet werden), "belichtet", entwickelt, gefärbt und ausgewertet.

Etablierte Zellinien und Lymphozyten

Autoradiographieverfahren: Die Zellkulturen werden jeweils während einer angemessenen Zeitdauer mit der Prüfsubstanz behandelt und dann mit³H-TdR behandelt. Die Zeiten richten sich nach Art der Substanz, Aktivität des Stoffwechselsystems und Zelltyp. Zur Ermittlung des UDS-Maximums ist³H-TdR entweder gleichzeitig mit der Prüfsubstanz oder innerhalb weniger Minuten danach zuzugeben.

Für welches dieser beiden Verfahren man sich entscheidet, hängt von der Möglichkeit einer Interaktion zwischen Prüfsubstanz und³H-TdR ab.

Um zwischen UDS und semikonservativer DNS-Replikation zu unterscheiden, kann letztere z.B. durch Verwendung eines argininfreien Mediums, durch geringen Serumgehalt oder Hydroxyharnstoff im Kulturmedium gehemmt werden.

Messungen der UDS mit dem LSC- Verfahren: Vor Behandlung mit der Prüfsubstanz sollte der Eintritt der Zellen in die S-Phase wie oben beschrieben blockiert werden. Anschließend sind die Zellen wie bei der Autoradiographie beschrieben mit der Prüfsubstanz zu behandeln. Nach Ende der Inkubationszeit extrahiert man die DNS aus den Zellen und bestimmt den gesamten DNS-Gehalt sowie die³H-TdR-Einbaurate.

Bei Verwendung nichtstimulierter menschlicher Lymphozyten erübrigen sich die oben genannten Verfahren zur Hemmung der semikonservativen DNS-Replikation.

Analyse

Autoradiographiebestimmung

Bei der Bestimmung der UDS an Zellen in Kultur werden die S-Phasen-Kerne nicht gezählt. Pro Konzentration sind bei der Zählung mindestens 50 Zellen zu erfassen. Die Objektträger sollten vor der Zählung kodiert werden. Auf jedem Objektträger sind mehrere weit auseinander liegende, nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Felder zu zählen. Das Ausmaß der Hintergrund-Markierung im Zytoplasma ist durch Zählung von drei Bereichen von der Größe eines Kerns im Zytoplasma jeder gezählten Zelle zu bestimmen.

Bestimmungen mit dem LSC-Verfahren

Bei Bestimmungen der UDS mit dem LSC-Verfahren ist eine angemessene Anzahl von Kulturen pro Konzentration und in den Kontrollen zu verwenden.

Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen.

B.18. 2. Daten

Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen.

B.18. 2.1. Autoradiographiebestimmungen

Das Ausmaß des³H-TdR-Einbaus im Zytoplasma und die Anzahl der Körner über dem Zellkern sind getrennt zu vermerken.

Zur Beschreibung der Verteilung der³H-TdR-Hintergrundmarkierung und der Anzahl der Granula pro Kern können Mittelwert, Medianwert und Modalwert verwendet werden.

B.18. 2.2. Bestimmungen mit dem LSC-Verfahren

Bei der Bestimmung mit dem LSC-Verfahren ist der³H-TdR-Einbau in dpm/µg DNS anzugeben. Zur Beschreibung der Einbauverteilung kann der Mittelwert für dpm/µg DNS mit Standardabweichung verwendet werden.

Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Verfahren erfolgen.

B.18. 3. Abschlußbericht

Prüfbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• verwendete Zellen, Dichte und Passagenanzahl und Zeitpunkt der Behandlung, Anzahl der Zellkulturen;
• zur Erstellung der Zellkulturen verwendete Verfahren einschließlich Medium, Temperatur und CO₂-Konzentrationen;
• Prüfsubstanz, Lösungsmitrelkonzentrarionen und Begründung für die Wahl der in dem Versuch verwendeten Konzentrationen;
• nähere Angaben zu den Stoffwechselaktivierungssystemen;
• Behandlungsplan;
• Positiv- und Negativkontrollen;
• verwendetes Autoradiographieverfahren;
• zur Blockierung des Eintritts der Zellen in die S-Phase verwendete Verfahren;
• zur DNS-Extraktion und Bestimmung des gesamten DNS-Gehalts im Rahmen des LSC-Verfahrens verwendete Methoden;
• ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;
• statistische Auswertung;
• Diskussion der Ergebnisse;
• Bewertung der Ergebnisse.

B.18. 3.2. Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung Teil B.

B.18. 4. Literatur

Siehe allgemeine Einleitung Teil B; H

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